À l’aide de l’analyse des taches lumineuses, le comportement des larves peut être suivi avant, pendant et après être entré dans la zone lumineuse, ce qui permet d’analyser le détail du mouvement larvaire. Cet essai est simple et facile à exécuter. La réponse lumineuse n’est testée qu’une seule fois, de sorte que tout effet possible de l’adaptation de la lumière peut être exclu.
Pour préparer les assiettes d’agar, couvrir lentement et uniformément le fond d’une boîte de Pétri de 15 centimètres avec une couche d’environ quatre millimètres d’épaisseur de 1% d’agar chaud. Laisser refroidir la plaque à température ambiante jusqu’à ce que l’agar se soit solidifié. Pour configurer le système de stimulation visuelle, coupez une source lumineuse LED préparée sur un cadre en fer, en prenant soin que la lumière se projette vers le bas vers le bureau.
Inclinez légèrement le cylindre jusqu’à ce que l’angle entre le plan du cylindre et le plan vertical soit d’environ 10 degrés. Connectez la lumière LED bleue de 470 nanomètres à la LED une prise du conducteur LED de haute puissance et allumez le conducteur. Tournez le bouton dans le coin supérieur droit du conducteur pour sélectionner le canal 470 nanomètres et cliquez sur LED.
Lorsque l’écran affiche une vérification, un point lumineux bleu apparaît sur le bureau. Cliquez SUR OK et tournez le bouton pour ajuster l’intensité de la lumière. Déplacez la position de la source lumineuse de haut en bas pour ajuster le diamètre du point lumineux à deux centimètres.
Faites pivoter le bouton pour sélectionner l’intensité lumineuse en fonction des exigences expérimentales. Utilisez une console compacte de compteur de puissance avec un capteur de puissance de diode photo standard pour mesurer la puissance lumineuse maximale et minimale sur place. La puissance lumineuse doit être mesurée dans l’obscurité dans l’expérience réelle.
Enregistrez ensuite la puissance lumineuse, mesurez-la trois fois et utilisez la valeur moyenne. Pour configurer le système d’imagination, serrez une caméra Web haute résolution avec un clip en fer à environ 10 centimètres au-dessus du point lumineux sur le bureau et ajustez l’orientation de l’objectif de la caméra vers le bureau. Connectez la caméra à un ordinateur fonctionnant sous Windows 7 via une interface USB et placez la plaque d’agar sur le bureau juste en dessous de la caméra.
Ouvrez le logiciel AMCap 9.22, le point lumineux sera automatiquement affiché dans la fenêtre AMCap. Déplacez la caméra légèrement à gauche ou à droite pour vous assurer que le point lumineux se trouve près du centre de la fenêtre. Utilisez un clip pour fixer un filtre bandpass de 850 plus ou moins trois nanomètres à cinq à sept millimètres immédiatement en dessous de la caméra.
Placez trois LED génératrices de lumière infrarouge avec une longueur d’onde centrale de 850 nanomètres uniformément autour de la plaque d’agar à environ cinq centimètres du bord de la plaque et avec des lentilles LED à un angle de 70 degrés face à la plaque. Connectez ensuite les LED à une source d’énergie par l’intermédiaire de leurs convertisseurs AC à DC. Dans le menu du logiciel AMCap, sélectionnez les options, l’appareil vidéo et le format de capture et réglez la taille des pixels de la vidéo capturée à 800 par 600 et le taux d’image à 60 images par seconde.
Retirez le filtre et placez une règle sous la caméra. Réglez la mise au point de la caméra jusqu’à ce que la ligne d’échelle soit claire et parallèle à la largeur du champ de vision vidéo et cliquez sur capture, configuration et capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement. Cliquez ensuite sur commencer à enregistrer pour enregistrer la distance réelle correspondant à 600 pixels et calculer le rapport de chaque pixel à la distance réelle.
Avant d’introduire la larve à la configuration d’imagerie, acquérir une courte vidéo de la position de la lumière et nommer la zone de lumière vidéo de fond de contrôle non filtrée un. Placez le filtre sur la lentille de la caméra et allumez une lumière loin du dispositif expérimental à un réglage aussi bas que possible tout en permettant aux larves d’être clairement observées. Utilisez une cuillère pour éliminer certaines larves du milieu de culture et sélectionnez délicatement une troisième larve de stade.
Laver la larve dans de l’eau distillée et placer la larve au centre de la plaque d’agar. Retirez délicatement l’excès d’eau de la larve et éteignez la lumière ambiante. Laissez la larve s’acclimater pendant deux minutes dans l’environnement sombre avant d’allumer la lumière infrarouge à LED.
L’expérience suivante de comportement d’évitement de la lumière doit être effectuée dans l’obscurité. Pour la commodité de la démonstration, nous avons filmé dans la lumière vive. Badigeonner délicatement la larve au centre de la plaque.
Lorsque la larve commence à ramper droit, faites pivoter la plaque pour faire la tête de larve vers le point lumineux. Cliquez sur capture, configuration et capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement et cliquez sur démarrer l’enregistrement pour enregistrer. Laissez la larve ramper vers, entrez et laissez le point lumineux jusqu’à ce qu’elle soit presque hors du champ de vision, et cliquez sur arrêter l’enregistrement.
Éloignez le filtre de la caméra et acquérez une courte vidéo de la position du point lumineux. Nommez ensuite la zone de lumière vidéo non filtrée de post-test deux et comparez cette vidéo avec la zone lumineuse une vidéo pour s’assurer que la position du point lumineux n’est pas modifiée. Ici, des courbes de temps de la vitesse de queue, de l’angle de flexion du corps et de la vitesse angulaire de flexion du corps d’une larve représentative peuvent être observées.
La taille de la tête larvaire coulée et, par conséquent, l’angle maximal de flexion du corps est significativement réduite dans les larves de troisième stade avec des neurones octopaminergiques inhibés par l’expression toxique du tétanos par rapport aux contrôles parentaux indiquant que les neurones Tdc2-Gal4 sont nécessaires pour une réponse normale de lumière larvaire. Pour un traitement d’image réussi, assurez-vous que l’appareil photo ne bloque pas la lumière et que le point lumineux est rond et près du centre de la fenêtre. Après cette procédure, l’optogénétique peut être effectuée pour observer comment les larves réagissent lorsque des neurones spécifiques sont activés.
À l’aide de cet essai, les détails du mouvement larvaire peuvent être analysés permettant d’étudier l’impact lointain de l’environnement et des facteurs internes sur le comportement larvaire d’évitement de la lumière.
