Mit dem Lichtfleck-Assay kann das Verhalten von Larven vor, während und nach dem Betreten des Lichtbereichs verfolgt werden, so dass die Details der Larvenbewegung analysiert werden können. Dieser Test ist einfach und einfach durchzuführen. Die Lichtreaktion wird nur einmal getestet, so dass ein möglicher Effekt der Lichtanpassung ausgeschlossen werden kann.
Um die Agarplatten vorzubereiten, bedecken Sie langsam und gleichmäßig den Boden einer 15 Zentimeter langen Petrischale mit einer etwa vier Millimeter dicken Schicht mit heißem 1%Agar. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur abkühlen, bis sich der Agar verfestigt hat. Um das visuelle Stimulationssystem einzurichten, klemmen Sie eine vorbereitete LED-Lichtquelle auf einen Eisenrahmen und achten Sie darauf, dass das Licht auf den Desktop hinabgeht.
Neigen Sie den Zylinder leicht, bis der Winkel zwischen der Zylinderebene und der vertikalen Ebene etwa 10 Grad beträgt. Schließen Sie das 470 Nanometer blaue LED-Licht an die LED ein Stecker des Hochleistungs-LED-Treibers an und schalten Sie den Treiber ein. Drehen Sie den Knopf in der oberen rechten Ecke des Treibers, um Kanal 470 Nanometer auszuwählen und auf LED zu klicken.
Wenn auf dem Bildschirm ein Scheck angezeigt wird, wird ein blauer Lichtfleck auf dem Desktop angezeigt. Klicken Sie auf OK und drehen Sie den Knopf, um die Intensität des Lichts anzupassen. Bewegen Sie die Position der Lichtquelle nach oben und unten, um den Durchmesser des Lichtflecks auf zwei Zentimeter einzustellen.
Drehen Sie den Knopf, um die Lichtintensität entsprechend den experimentellen Anforderungen auszuwählen. Verwenden Sie eine kompakte Leistungskonsole mit einem Standard-Fotodioden-Leistungssensor, um die maximale und minimale Lichtleistung vor Ort zu messen. Die Lichtkraft muss im eigentlichen Experiment im Dunkeln gemessen werden.
Zeichnen Sie dann die Lichtleistung auf, messen Sie sie dreimal und verwenden Sie den Durchschnittswert. Um das Imaginierungssystem einzurichten, klemmen Sie eine hochauflösende Webkamera mit einem Eisenclip etwa 10 Zentimeter über dem Lichtfleck auf dem Desktop und passen Sie die Ausrichtung der Kameralinse zum Desktop an. Schließen Sie die Kamera über eine USB-Schnittstelle an einen Computer mit Windows 7 an und platzieren Sie die Agarplatte auf dem Desktop direkt unter der Kamera.
Öffnen Sie die AMCap 9.22 Software, der Lichtfleck wird automatisch im AMCap-Fenster angezeigt. Bewegen Sie die Kamera leicht nach links oder rechts, um sicherzustellen, dass sich der Lichtfleck in der Nähe der Mitte des Fensters befindet. Verwenden Sie einen Clip, um einen 850 plus oder minus drei Nanometer Bandpassfilter mit fünf bis sieben Millimetern direkt unter der Kamera zu fixieren.
Platzieren Sie drei Infrarot-Licht erzeugende LEDs mit einer zentralen Wellenlänge von 850 Nanometern gleichmäßig um die Agarplatte, etwa fünf Zentimeter vom Rand der Platte entfernt und mit LED-Objektiven in einem 70-Grad-Winkel zur Platte gerichtet. Schließen Sie dann die LEDs über ihre AC-zu-DC-Wandler an eine Stromquelle an. Wählen Sie im Menü der AMCap-Software Optionen, Videogerät und Aufnahmeformat aus und legen Sie die Pixelgröße des aufgenommenen Videos auf 800 x 600 und die Bildrate auf 60 Bilder pro Sekunde fest.
Entfernen Sie den Filter, und legen Sie ein Lineal unter die Kamera. Passen Sie den Kamerafokus so lange an, bis die Skalierungslinie klar und parallel zur Breite des Videofelds ist, und klicken Sie auf Aufnahme, Einrichtung und Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen. Klicken Sie dann auf Aufnahme starten, um den tatsächlichen Abstand von 600 Pixeln aufzuzeichnen und das Verhältnis jedes Pixels zur tatsächlichen Entfernung zu berechnen.
Bevor Sie die Larve in das Bildgebungs-Setup einführen, erfassen Sie ein kurzes Video der Lichtposition und benennen Sie den ungefilterten Kontrollhintergrund-Videolichtbereich eins. Legen Sie den Filter wieder auf das Kameraobjektiv und schalten Sie ein Licht weit weg vom Versuchsgerät bei einer möglichst niedrigen Einstellung ein, während die Larven dennoch deutlich beobachtet werden können. Verwenden Sie einen Löffel, um einige Larven aus dem Kulturmedium zu entfernen und wählen Sie vorsichtig eine dritte Instar Larve.
Waschen Sie die Larve in destilliertem Wasser und legen Sie die Larve in die Mitte der Agarplatte. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Wasser aus der Larve und schalten Sie das Raumlicht aus. Lassen Sie die Larve für zwei Minuten in der dunklen Umgebung akklimatisieren, bevor Sie das Infrarot-LED-Licht einschalten.
Das folgende Lichtvermeidungsverhaltensexperiment muss im Dunkeln durchgeführt werden. Für die Bequemlichkeit der Demonstration haben wir im hellen Licht gefilmt. Bürsten Sie die Larve vorsichtig in die Mitte der Platte.
Wenn die Larve gerade zu kriechen beginnt, drehen Sie die Platte, um die Larve in Richtung des Lichtflecks zu bewegen. Klicken Sie auf Aufnahme, Einrichtung und Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen und auf Aufzeichnung starten, um aufzunehmen. Lassen Sie die Larven kriechen, betreten und lassen Sie den Lichtfleck, bis er fast aus dem Sichtfeld entfernt ist, und klicken Sie auf Aufnahme beenden.
Bewegen Sie den Filter von der Kamera weg und erfassen Sie ein kurzes Video von der Position des Lichtflecks. Benennen Sie dann den Post-Assay ungefilterten Videolichtbereich zwei und vergleichen Sie dieses Video mit dem Lichtbereich ein Video, um sicherzustellen, dass die Lichtfleckposition nicht geändert wird. Hierkönnen können Zeitkurven der Schwanzgeschwindigkeit, des Körperbiegewinkels und der Winkelgeschwindigkeit der Körperbiegung einer repräsentativen Larve beobachtet werden.
Die Größe des Larvenkopfgusses und damit des maximalen Körperbiegewinkels wird bei dritten Insternlarven mit octopaminergen Neuronen, die durch tetanus toxische Expression gehemmt sind, im Vergleich zu der elterlichen Kontrolle deutlich reduziert, was darauf hindeutet, dass Tdc2-Gal4-Neuronen für eine normale Larvenlichtreaktion notwendig sind. Stellen Sie für eine erfolgreiche Bildverarbeitung sicher, dass die Kamera das Licht nicht blockiert und dass der Lichtfleck rund und in der Mitte des Fensters ist. Nach diesem Verfahren kann eine Optogenetik durchgeführt werden, um zu beobachten, wie die Larven reagieren, wenn bestimmte Neuronen aktiviert werden.
Mit diesem Test können die Details der Larvenbewegung analysiert werden, so dass die weiten Auswirkungen von Umwelteinflüssen und internen Faktoren auf das Larvenlichtvermeidungsverhalten untersucht werden können.
