Измерение реактивных видов кислорода или ROS, как известно, проблематично. В этом видео мы продемонстрируем воспроизводимое измерение ROS в ответ на перекрестное скрещивание рецепторов FC-гамма с использованием флуоресцентных зондов и цитометрии потока. Основными преимуществами этого метода являются воспроизводимость анализа и использование этого метода с конкретными антигенными стимулами, а не только митогенами или известными индукторами ROS.
Дисрегулируемое производство ROS имеет центральное значение для развития многих заболеваний, таких как хронические гранулематозные заболевания или CGD. Точное измерение ROS может составлять одну часть молекулярной диагностики CGD. Изучение производства FC-опосредованного ROS имеет важное значение в изучении иммунодефицитов, таких как CGD, но и в изучении аутоиммунного заболевания, или нейродегенеративных заболеваний, где слишком много ROS приводит к окислительному стрессу и воспалению.
Сроки проведения анализа имеют решающее значение. Я бы посоветовал кому-то попробовать этот протокол в первый раз, чтобы подготовиться тщательно и сделать макет эксперимента, если это возможно. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для того, чтобы подчеркнуть шаги анализа, которые нуждаются в особом внимании, таких как сроки анализа.
Для начала подготовьтесь к макрофагам, полученным из костного мозга, используя условные средства массовой информации, описанные в сопроводительном текстовом протоколе. После грунтовки макрофагов на ночь, аспирировать супернатант и мыть клетки один раз с PBS. Сыворотка голодают клетки, заменив средства массовой информации с тем же объемом с низким содержанием сыворотки DMEM.
Для каждой мыши, одна пластина будет рассматриваться с анти-BSA IgG1 в то время как сыворотка голодает, а другая останется без лечения. Добавьте только низкосерийный DMEM к необработанным пластинам и добавьте в обработанные пластины DMEM с низким содержанием сыворотки, содержащий 2,5 микрограмма на миллилитр мурина anti-BSA IgG1. Обязательно включите одну дополнительную необработанную пластину для каждого эксперимента, чтобы выступать в качестве контроля цитометрической компенсации потока.
Инкубировать пластины четыре часа при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2. Во время четырехчасовой инкубации подготовьтесь к 2X-решению реактивных зондов видов кислорода. На каждые 10 миллилитров необходимого DMEM с низким содержанием сыворотки добавьте четыре микролитров окислительного реагента обнаружения стресса и четыре микролитера реагента обнаружения супероксида.
Затем подготовь решения зонда 2X, содержащие только окислительный реагент обнаружения стресса или содержащие только реагент обнаружения супероксида. После четырехчасовой инкубации, урожай клеток, осторожно соскоб пластин, собирая их в помечены, пять миллилитров круглого дна труб. Центрифуга труб при 750 раз г в течение пяти минут.
Не забудьте отслеживать, какие клетки были обработаны мурин анти-BSA IgG1. Далее, мыть клеточные гранулы с двумя миллилитров PBS, чтобы избавиться от любых остаточных анти-BSA из обработанных клеток. Центрифуга труб при 750 раз г в течение пяти минут.
Затем, аспирировать PBS и повторного перерасхода клеток гранулы в 600 микролитров с низким содержанием сыворотки DMEM. Из 600-микролитровой клеточной подвески, aliquot 200 микролитров в предварительно помеченные пятими миллилитровые круглые нижние трубки. Из необработанных клеток возьмите 200 микролитров для трубок, помеченных нестимулированными, 200 микролитров для трубок с маркировкой положительного индуктора и 200 микролитров для труб с маркировкой положительного индуктора плюс ингибитор.
Затем, из анти-BSA IgG1 обработанных клеток, принять 200 микролитров для труб помечены FC-гамма рецепторов перекрестного, и 200 микролитров для труб помечены FC-гамма-рецептор перекрестного плюс ингибитор. Из необработанных клеток, которые будут использоваться для компенсации контроля, принять 200 микролитров для трубки помечены неочищенных unstimulated, 200 микролитров для зеленого плюс индуктор управления, и 200 микролитров для оранжевого плюс индуктор контроля. Приготовьте 2X положительный индукторный раствор, разбавляя pyocyanin от одного до 100 в каждом из 2X зонд решений в концентрации 500 микромоляров.
Затем подготовь решение 2X BSA, разбавляя решение BSA в растворе зонда 2X, чтобы получить 2X-концентрацию в два микрограмма на миллилитр. Перед началом специфической стимуляции, такой как перекрестное скрещивание рецепторов FC-gamma, убедитесь, что все реагенты и клетки готовы и поместите трубки на лед в том порядке, в котором они будут стимулироваться. Для цитометров потока с помощью автоамплера обратите внимание на время, которое требуется цитометру для анализа одного образца и перехода к следующему.
Обязательно включите любые шаги смешивания и промывания зонда. Сроки очень важно для этого анализа. Для того, чтобы каждое условие было хорошо контролируется, стимуляция должна быть проведена ровно в 30 минут для каждого состояния.
Стимулируть клетки в порядке и включать время задержки между приобретениями выборки потоком цитометра. При выполнении ручной компенсации на данный момент, стимулировать контрольные трубы, которые будут использоваться для компенсации, добавив 200 микролитров 2X зонд решение, содержащее окислительный реагент обнаружения стресса и индуктор в трубки отмечены зеленый плюс индуктор. Затем добавьте 200 микролитров раствора зонда 2X, содержащего реагент обнаружения супероксида и индуктор в трубки с оранжевым плюс индуктор.
Инкубировать клетки в течение 30 минут в темноте. Используя программное обеспечение цитометрии потока, генерировать и маркировать три образца файлов для управления, незапачканные, необработанные, зеленый плюс индуктор, и оранжевый плюс индуктор образцов, убедившись, что указать каналы и параметры, которые будут проанализированы. Кроме того, введите желаемые условия остановки.
После настройки контрольных образцов создать и обозначить аналогичный набор файлов для экспериментальных образцов. Теперь запустите неочищенный, необработанный образец. Откройте точечный участок для форварда рассеяния по оси X по сравнению с боковым рассеянием на оси Y и нарисуйте ворота вокруг представляющих интерес ячеек, исключая мертвые клетки и мусор.
Затем используйте ворота этой ячейки, чтобы открыть еще один точечный участок первого маркера флуоресценции, FL1, на X-оси, по сравнению со вторым маркером флуоресценции, FL2, на оси Y. Нарисуйте начальные квадрантные ворота, а затем отрегулируйте квадрантные ворота так, чтобы события появились на левом нижнем квадранте участка FL1 против FL2. После завершения, запустить зеленый плюс индуктор образца.
Отрегулируйте напряжение так, чтобы события появлялись на левом нижнем и правом квадрантах участка FL1 против FL2. Затем примените эту матрицу компенсации ко всем трем файлам образца. Теперь запустите оранжевый плюс образец индуктора.
Отрегулируйте напряжение так, чтобы события появлялись на верхних и нижних левых квадрантах участка FL1 против FL2, а затем примените эту матрицу компенсации ко всем трем файлам образца. Проверьте каждый файл компенсации и убедитесь, что неочищенные, необработанные события появляются на левом нижнем квадранте, зеленые плюс индукторные события появляются на нижних левых и правых квадрантах, а оранжевые плюс индукторные события появляются на верхних и нижних левых квадрантах участка FL1 против FL2. Затем примените матрицу компенсации ко всем экспериментальным файлам образца.
После того, как ручная компенсация была выполнена и экспериментальный шаблон был получен, перейти к экспериментальным образцам. Перед лечением клеток с положительным индуктором или проведением стимуляции клеток FC-гамма-рецепторов, отметь, какие трубки получат ингибитор ROS. Лечить эти клетки с ингибитором ROS по крайней мере за 30 минут до положительного индуктора или стимуляции рецепторов FC-гамма, добавив один микролитр ингибитора до 200 микролитров resuspended клеток для окончательной концентрации пяти миллимоляров.
Для нестимулированных клеток, лечить клетки с 200 микролитров 2X зонда решение без каких-либо стимулов добавил к 200 микролитров клеточной подвески помечены окрашенные, unstimulated. Для положительного контроля, лечить клетки с 200 микролитров 2X положительный индуктор решение 200 микролитров клеточной подвески помечены положительный индуктор или положительный индуктор плюс ингибитор. Наконец, для клеток, стимулируемых перекрестного пересечения рецепторов FC-гамма, лечить их с 200 микролитров 2X BSA решение добавил к 200 микролитров клеточной подвески помечены FC-гамма-рецептор перекрестного или FC-гамма-рецептор перекрестного плюс ингибитор.
Инкубировать клетки в течение 30 минут в темноте. После инкубации проанализируйте образцы в том порядке, в котором они стимулировались, используя цитометр потока и шаблоны анализа, генерируемые в ходе первоначальных компенсационных шагов. Данные, показанные здесь, демонстрируют цитометрическое обнаружение потока реактивных видов кислорода в результате стимуляции макрофагов через рецептор FC-gamma.
Существует заметное увеличение FL1 и FL2 флуоресценции, когда клетки стимулируются с FC-гамма рецепторов перекрестного агента. Когда клетки были обработаны с реактивным ингибитором вида кислорода до перекрестного пересечения рецепторов FC-гамма, это увеличение флуоресценции возвращается к базальным уровням. В отличие от этого, эти точечные участки представляют если неуспешный эксперимент, где наблюдалось неоптимального реактивного производства кислорода в результате стимуляции FC-гамма-рецепторов.
Чтобы подчеркнуть большие различия между ожидаемыми процентами или увеличением МФО, эти данные показывают, как выглядят образцы с минимальным увеличением флуоресценции FL1 и FL2. Текущий протокол использует 24-часовой этап грунтовки. При сравнении 24-часового по сравнению с 48-часовым временем грунтовки, не было заметной разницы в проценте клеток, положительных для зеленого окислительного реагента стресса.
Тем не менее, увеличение времени грунтовки до 48 часов сделал увеличить процент клеток положительные для оранжевой флуоресценции. Наиболее важные вещи, чтобы помнить при выполнении этой процедуры планирует заранее, и быть последовательным о сроках анализа, чтобы получить воспроизводимые результаты.
