La mesure des espèces réactives d’oxygène ou ROS est notoirement problématique. Dans cette vidéo, nous démontrerons la mesure reproductible de ROS en réponse à la liaison croisée des récepteurs FC-gamma à l’aide de sondes fluorescentes et de cytométrie d’écoulement. Les principaux avantages de cette technique sont la reproductibilité de l’analyse et l’utilisation de cette méthode avec des stimuli antigéniques spécifiques, pas seulement des mitogènes ou des inducteurs ROS connus.
La production de ROS dysregulated est centrale au développement de nombreuses maladies telles que la maladie granulomatous chronique ou la DGCC. La mesure précise du ROS pourrait constituer une partie du diagnostic moléculaire de la DGCC. L’étude de la production de ROS à 100 000 FC est importante dans l’étude des immunodéficiences, comme la DGC, mais aussi dans l’étude des maladies auto-immunes, ou des maladies neurodégénératives, où trop de ROS conduit au stress oxydatif et à l’inflammation.
Le moment de l’analyse est critique. Je conseillerais à quelqu’un qui essaie ce protocole pour la première fois de bien se préparer et de faire une simulation d’expérience si possible. Démonstration visuelle de cette méthode est critique afin de souligner les étapes de l’essai qui ont besoin d’une attention particulière comme le moment de l’essai.
Pour commencer, préparez des macrophages dérivés de la moelle osseuse à l’aide de supports conditionnés tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne. Après l’amorçage des macrophages pendant la nuit, aspirer le supernatant et laver les cellules une fois avec PBS. Le sérum affame les cellules en remplaçant les médias par le même volume de DMEM à faible sérum.
Pour chaque souris, une plaque sera traitée avec anti-BSA IgG1 tandis que le sérum affamé tandis que l’autre ne sera pas traitée. Ajouter seulement le DMEM à faible sérum aux plaques non traitées et ajouter du DMEM à faible sérum contenant 2,5 microgrammes par millilitre d’anti-BSA IgG1 murin aux plaques traitées. Assurez-vous d’inclure une plaque supplémentaire non traitée pour chaque expérience afin d’agir comme le contrôle de la compensation cytométrique du flux.
Incuber les plaques quatre heures à 37 degrés Celsius, 5% de CO2. Pendant l’incubation de quatre heures, préparer une solution 2X des sondes réactives d’espèces d’oxygène. Pour chaque tranche de 10 millilitres de DMEM à faible sérum nécessaire, ajouter quatre microlitres d’un réaccéléologue oxydatif de détection du stress et quatre microlitres d’un réaccéléologue de détection de superoxyde.
Ensuite, préparez les solutions de sonde 2X contenant uniquement le reagent oxydatif de détection de stress ou ne contenant que le réaccente de détection de superoxyde. Après l’incubation de quatre heures, récolter les cellules en raclant doucement les plaques, en les recueillant dans des tubes à fond rond étiquetés de cinq millilitres. Centrifuger les tubes à 750 fois g pendant cinq minutes.
Assurez-vous de garder une trace des cellules qui ont été traitées avec murine anti-BSA IgG1. Ensuite, lavez les granulés cellulaires avec deux millilitres de PBS pour se débarrasser de tout anti-BSA résiduel des cellules traitées. Centrifuger les tubes à 750 fois g pendant cinq minutes.
Ensuite, aspirez le PBS et résuspendez la pastille cellulaire dans 600 microlitres de DMEM à faible sérum. De la suspension cellulaire de 600 microlitres, aliquot 200 microlitres dans les tubes à fond rond préétiquetés de cinq millilitres. À partir des cellules non traitées, prendre 200 microlitres pour les tubes étiquetés non formulés, 200 microlitres pour les tubes étiquetés inducteur positif, et 200 microlitres pour les tubes étiquetés inducteur positif plus inhibiteur.
Ensuite, à partir des cellules traitées anti-BSA IgG1, prendre 200 microlitres pour les tubes étiquetés FC-gamma récepteur crosslinking, et 200 microlitres pour les tubes étiquetés RÉCEPTEUR FC-gamma croisement plus inhibiteur. Des cellules non traitées à utiliser pour les contrôles de compensation, prendre 200 microlitres pour le tube étiqueté non taché non formulé, 200 microlitres pour le contrôle vert plus inducteur, et 200 microlitres pour orange plus le contrôle inducteur. Préparez une solution d’incitation positive 2X en diluant la pyocyanine d’un à 100 dans chacune des solutions de sonde 2X à une concentration de 500 micromolaires.
Ensuite, préparez une solution BSA 2X en diluant la solution de stock BSA dans la solution de sonde 2X pour obtenir une concentration de 2X de deux microgrammes par millilitre. Avant de commencer la stimulation spécifique, comme la liaison croisée des récepteurs FC-gamma, assurez-vous que tous les réavants et cellules sont prêts et placez les tubes sur la glace dans l’ordre dans lequel ils seront stimulés. Pour les cytomètres d’écoulement avec un autosampler, prenez note du temps que le cytomètre prend pour analyser un échantillon et passer à l’autre.
Assurez-vous d’inclure toutes les étapes de mélange et de lavage des sondes. Le timing est très critique pour cet essai. Pour que chaque condition soit bien contrôlée, la stimulation doit être effectuée en exactement 30 minutes pour chaque condition.
Stimulez les cellules dans l’ordre et incorporez le décalage entre les acquisitions d’échantillons par le cytomètre à écoulement. Si vous effectuez une compensation manuelle à ce stade, stimulez les tubes de commande à utiliser pour la compensation en ajoutant 200 microlitres de la solution de sonde 2X contenant le réaccente oxydative de détection de stress et l’inducteur dans les tubes marqués vert plus inducteur. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution de sonde 2X contenant le réaccente de détection de superoxyde et l’inducteur dans les tubes marqués orange plus inducteur.
Incuber les cellules pendant 30 minutes dans l’obscurité. À l’aide du logiciel de cytométrie du flux, générer et étiqueter trois fichiers d’échantillons pour le contrôle, non taché, non traité, le vert plus inducteur, et l’orange plus échantillons inducteurs, en s’assurant d’indiquer les canaux et les paramètres à analyser. En outre, entrez les conditions d’arrêt souhaitées.
Une fois que les échantillons de contrôle ont été mis en place, générer et étiqueter un ensemble similaire de fichiers pour les échantillons expérimentaux. Maintenant, exécutez l’échantillon non taché et non traité. Ouvrez une parcelle de points pour la dispersion vers l’avant sur l’axe X par rapport à la dispersion latérale sur l’axe Y et dessinez une porte autour des cellules d’intérêt, à l’exclusion des cellules mortes et des débris.
Ensuite, utilisez la porte de cette cellule pour ouvrir une autre parcelle de point du premier marqueur de fluorescence, FL1, sur l’axe X, par rapport au deuxième marqueur de fluorescence, FL2, sur l’axe Y. Dessinez une porte de quadrant initiale, puis ajustez la porte quadrant de sorte que les événements apparaissent sur le quadrant inférieur gauche de la parcelle FL1 contre FL2. Une fois terminé, exécutez l’échantillon vert plus inducteur.
Réglez la tension de sorte que les événements apparaissent sur les quadrants inférieur gauche et droit de l’intrigue FL1 contre FL2. Ensuite, appliquez cette matrice de rémunération aux trois fichiers d’échantillons. Maintenant, exécutez l’échantillon orange plus inducteur.
Ajustez la tension de sorte que les événements apparaissent sur les quadrants supérieur et inférieur gauche de la parcelle FL1 versus FL2, puis appliquez cette matrice de compensation aux trois fichiers d’échantillon. Vérifiez chaque fichier d’indemnisation et assurez-vous que des événements non tachés et non traités apparaissent sur le quadrant inférieur gauche, que les événements verts plus inducteurs apparaissent dans les quadrants inférieur gauche et droit, et que les événements orange plus inducteur apparaissent sur les quadrants supérieur et inférieur gauche de la parcelle FL1 contre FL2. Ensuite, appliquez la matrice de rémunération à tous les fichiers d’échantillons expérimentaux.
Une fois que la compensation manuelle a été effectuée et qu’un modèle expérimental a été obtenu, passez aux échantillons expérimentaux. Avant de traiter les cellules avec un inducteur positif ou d’effectuer la stimulation des cellules récepteurs FC-gamma, marquez quels tubes recevront un inhibiteur ros. Traitez ces cellules avec l’inhibiteur ros au moins 30 minutes avant l’inducteur positif ou la stimulation des récepteurs FC-gamma en ajoutant un microlitre de l’inhibiteur à 200 microlitres de cellules résuspendues pour une concentration finale de cinq millimolaires.
Pour les cellules non simulées, traiter les cellules avec 200 microlitres de la solution de sonde 2X sans aucun stimulus ajouté aux 200 microlitres de suspension cellulaire étiquetés tachés, non stimulés. Pour les contrôles positifs, traiter les cellules avec 200 microlitres de la solution d’incitation positive 2X à 200 microlitres de suspension cellulaire étiquetés inducteur positif ou inducteur positif plus inhibiteur. Enfin, pour les cellules stimulées par la liaison croisée des récepteurs FC-gamma, traitez-les avec 200 microlitres de la solution 2X BSA ajoutées à 200 microlitres de la suspension cellulaire étiquetée liaison croisée des récepteurs FC-gamma ou liaison croisée des récepteurs FC-gamma plus inhibiteur.
Incuber les cellules pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après l’incubation, analyser les échantillons dans l’ordre dans lequel ils ont été stimulés, à l’aide du cytomètre d’écoulement et des modèles d’analyse générés au cours des étapes initiales de compensation. Les données présentées ici démontrent la détection cytométrique de flux de la production réactive d’espèces d’oxygène résultant de la stimulation des macrophages par le récepteur FC-gamma.
Il y a une augmentation marquée de la fluorescence de FL1 et de FL2 quand les cellules sont stimulées avec l’agent de liaison croisée de récepteur de FC-gamma. Lorsque les cellules ont été traitées avec l’inhibiteur réactif des espèces d’oxygène avant la liaison croisée des récepteurs FC-gamma, cette fluorescence accrue est ramenée à des niveaux basaux. En revanche, ces parcelles de points présentent une expérience infructueuse, où la production réactive sous-optimale d’espèces d’oxygène à la suite de la stimulation des récepteurs FC-gamma a été observée.
Pour mettre en évidence les grandes différences entre les pourcentages attendus, ou les augmentations de l’IMF, ces données montrent à quoi ressemblent les échantillons dont la fluorescence fl1 et FL2 est minime. Le protocole actuel utilise une étape d’amorçage 24 heures sur 24. En comparant un temps d’amorçage de 24 heures par rapport à un temps d’amorçage de 48 heures, il n’y avait aucune différence marquée dans le pourcentage de cellules positives pour le reagent oxydant vert d’effort oxydant.
Cependant, l’augmentation du temps d’amorçage à 48 heures a augmenté le pourcentage de cellules positives pour la fluorescence orange. Les choses les plus importantes à retenir lors de l’exécution de cette procédure est la planification à venir, et d’être cohérent sur le moment de l’essai pour obtenir des résultats reproductibles.
