Этот протокол использует обтекаемый подход для измерения экспрессии генов растений в ответ на травоядное насекомое. С помощью отдельных листьев, изолированных в чашках Петри, насекомые легче применять и контролировать в течение относительно короткого периода заражения способствует воспроизводимых данных экспрессии генов. Этот протокол может быть адаптирован к многим взаимодействиям растений и насекомых.
если учитывать базовые наблюдения из целых систем завода. Непредсказуемый характер кормления насекомыми может быть сложной задачей. Таким образом, надежный запас правильно постановочных личинок и здоровых растений обеспечивает наилучшие шансы на успех.
Визуализация того, как должны выглядеть и вести себя здоровые растения и насекомые, играет важную роль в достижении оптимальных результатов, особенно для исследователей, новых в области исследований. Демонстрация процедуры со мной будет Фрэнсис Перес, молекулярный биолог в генетическом улучшении фруктов и овощей лаборатории. Для приготовления узловой размножаемой ткани культуры картофельных растений, сначала получить Kennebec растения, выращенные из экза растительного материала, по крайней мере три-четыре узла.
Используйте стерильное лезвие, чтобы удалить листья резки ветви близко к основной стебель и оставив около двух миллиметров ветви ткани на лист. Вырезать примерно два миллиметра выше и ниже каждого узла, чтобы удалить узел разделы из стеблей и организовать узел черется в стерильной ткани культуры сосуд, содержащий узел передачи среды с ветвью указывая вверх. Затем перенесите нордные чере переноса в культурную камеру растительной ткани на две-три недели роста при 24 градусах По Цельсию и 16-часовой световой, восьмичасовой темный фото период.
Чтобы подготовить насекомых к кормлению, получить желаемую личиночковую стадию M.sexta и перенести по одной личинке в каждую колодец соответствующего сосуда в зависимости от размера личинки. Сделайте шаблоны размещения для каждой точки времени сбора урожая, используя пять крепких подносов, способных держать набор из шести надлежащим размером с чашки Петри, облицованные белой бумагой. Отслеживайте набор из шести кругов, используя чашку Петри соответствующего размера на бумаге в каждом подносе и наклейте на этикетку один набор кругов управления A, B и C, а другой зараженный A, B и C.Then обозначит каждый шаблон размещения соответствующим временем сбора урожая.
Далее, этикетка один 1,7 миллилитров микроцентрифуг трубки для каждого круга в шаблоне размещения, чтобы надлежащим образом определить возмущение, письмо репликации растений и точки времени сбора урожая. Когда все трубки были помечены, поместите стерильный бумажный диск фильтра в одну чашку Петри на шаблон и смочить диски стерильной водой, не давая избыток жидкого бассейна в каждом блюде. Затем поместите одно блюдо в каждый круг в каждом шаблоне размещения и поместите три картофельных растения одного возраста и относительного размера рядом с каждым шаблоном размещения.
Чтобы инициировать заражение, используйте стерильные ножницы, чтобы удалить два верхних размера соответствует листья от каждого растения и место один лист в контрольной чашке Петри и один в зараженных Петри блюдо для каждого растения как можно быстрее. Когда все листья были помещены, используйте мягкие миппы касания для передачи по крайней мере одной личинки в каждое зараженное блюдо как можно быстрее и установить таймер для желаемого времени заражения. Наблюдайте за кормлением, чтобы убедиться, что все личинки едят, заменяя любые некормленные личинки по мере необходимости.
Удалите все личинки из всех листьев в конце времени заражения и начать таймер для сбора урожая. В конце каждой точки времени сбора урожая, передать каждый лист в соответствующую трубку и сразу же падение трубки в жидкий азот, чтобы заморозить образец листа перед хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию до изоляции РНК. Здоровые точно постановочные личинки должны начать кормление сразу после размещения на поверхности листа и кормление должно продолжаться в достаточно последовательной манере на протяжении всего периода времени заражения.
Личинка в нижней части этого листа не потребляется какой-либо растительный материал и является примером неудачного заражения. Эти листья были отделены от двухнедельного вандала размножаются растения культуры тканей и потребляется с разной скоростью и кормления стилей для каждого личинок этапе. На основе этих результатов были отобраны четвертые личинки instar для дальнейшей оценки повреждений листьев для более зрелых почвенных растений картофеля, которые более приближены к выращенным на поле картофельным растениям.
В этих исследованиях экспрессии генов, два новых C2H2 цинка палец транскрипции факторов, которые надежно реагируют на M.sexta травоядных были определены поддержку использования отдельных листьев для заражения анализов. Не забудьте использовать возраст и размер соответствующих листьев и правильно этап личинок для каждого эксперимента, как единообразие приводит к более воспроизводимых данных. Ткани листьев могут быть анализированы на стресс-индукционных реактивных видов кислорода и производных гормона ясмоновой кислоты.
Целый транскриптом, протеом, или микробиом исследования также могут быть выполнены на листовых тканях.
