Este protocolo utiliza un enfoque simplificado para medir la expresión génica de la planta en respuesta al herbívoro de insectos. Mediante el uso de hojas separadas aisladas en platos Petri, los insectos son más fáciles de aplicar y monitorear durante el período relativamente corto de infestación contribuyendo a datos reproducibles de expresión génica. Este protocolo puede adaptarse a muchas interacciones entre plantas y insectos.
si se consideran las observaciones de referencia de sistemas vegetales enteros. La naturaleza impredecible de la alimentación de insectos puede ser un desafío. Por lo tanto, un suministro confiable de larvas correctamente escenificadas y plantas sanas proporcionan la mejor oportunidad de éxito.
Visualizar cómo deben aparecer y comportarse las plantas e insectos sanos es fundamental para lograr resultados óptimos, especialmente para los investigadores nuevos en el campo de estudio. Demostrando el procedimiento conmigo estará Frances Pérez, una bióloga molecular en el laboratorio de mejora genética de frutas y verduras. Para preparar plantas de patata de cultivo de tejido propagado nodal, primero obtenga plantlets Kennebec cultivados a partir de material explantado con al menos tres a cuatro nodos.
Utilice una cuchilla estéril para eliminar las hojas cortando las ramas cerca del tallo principal y dejando alrededor de dos milímetros de tejido de rama por hoja. Corte aproximadamente dos milímetros por encima y por debajo de cada nodo para eliminar las secciones nodales de los tallos y organizar los esquejes nodales en un recipiente de cultivo de tejido estéril que contenga un medio de transferencia nodal con la rama apuntando hacia arriba. Luego transfiera los esquejes nodales a una cámara de cultivo de tejido vegetal para dos o tres semanas de crecimiento a 24 grados centígrados y un período de foto oscuro de 16 horas de luz y ocho horas.
Para preparar los insectos para la alimentación, obtener la etapa larval deseada de M.sexta y transferir una larva a cada pozo de un recipiente de contención apropiado de acuerdo con el tamaño de la larva. Haga plantillas de colocación para cada punto de tiempo de cosecha utilizando cinco bandejas resistentes capaces de sostener un conjunto de seis platos Petri de tamaño adecuado forrados con papel blanco. Trace un conjunto de seis círculos usando el plato Petri del tamaño adecuado en el papel en cada bandeja y etiquete un conjunto de círculos control A, B y C y el otro infestado A, B y C.Then etiquete cada plantilla de colocación con el tiempo de cosecha adecuado.
A continuación, etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para cada círculo de la plantilla de colocación para identificar adecuadamente la perturbación, la letra de replicación de la planta y el punto de tiempo de cosecha. Cuando todos los tubos hayan sido etiquetados, coloque un disco de papel de filtro estéril en un plato de Petri por plantilla y humedezca los discos con agua estéril sin dejar que el exceso de líquido se acose en cada plato. A continuación, coloque un plato en cada círculo en cada plantilla de colocación y coloque tres plantas de papa de la misma edad y tamaño relativo junto a cada plantilla de colocación.
Para iniciar la infestación, utilice tijeras estériles para eliminar las hojas superiores de dos tamaños de cada planta y coloque una hoja en el plato petri de control y una en el plato Petri infestado para cada planta lo más rápido posible. Cuando se hayan colocado todas las hojas, utilice fórceps táctiles suaves para transferir al menos una larva a cada plato infestado lo más rápido posible y ajuste el temporizador para el tiempo de infestación deseado. Observe la alimentación para asegurarse de que todas las larvas están comiendo, reemplazando cualquier larva no alimentada según sea necesario.
Retire todas las larvas de todas las hojas al final del tiempo de infestación e inicie el temporizador para la cosecha. Al final de cada punto de tiempo de cosecha, transfiera cada hoja al tubo correspondiente y suelte inmediatamente el tubo en nitrógeno líquido para congelar la muestra de la hoja antes de almacenarla a menos 80 grados centígrados hasta el aislamiento del ARN. Las larvas saneadas con etapas precisas deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la colocación en la superficie de la hoja y la alimentación debe continuar de manera bastante consistente durante todo el período de tiempo de infestación.
La larva en el fondo de esta hoja no consumió ningún material vegetal y es un ejemplo de una infestación infructuosa. Estas hojas se separaron de las plantas de cultivo de tejido propagado nodal de dos semanas de edad y se consumieron a diferentes velocidades y estilos de alimentación para cada etapa larval. Sobre la base de estos resultados, se seleccionaron las cuartas larvas instar para evaluar aún más el daño a las hojas de las plantas de papa cultivadas en suelo más maduro que se aproximan más a las plantas de papa cultivadas en el campo.
En estos estudios de expresión génica, se identificaron dos nuevos factores de transcripción de dedos de zinc C2H2 que responden robustamente al herbívoro M.sexta apoyando el uso de hojas separadas para ensayos de infestación. Recuerde usar la edad y el tamaño de las hojas emparejadas y para escenificar adecuadamente las larvas para cada experimento como la uniformidad resulta en datos más reproducibles. Los tejidos de las hojas se pueden ensayar para especies de oxígeno reactivo inducidas por el estrés y derivados de la hormona del ácido jasmónico.
También se pueden realizar estudios completos de transcriptoma, proteoma o microbioma en los tejidos de las hojas.
