Este protocolo usa uma abordagem simplificada para medir a expressão genética da planta em resposta à herbívora de insetos. Ao usar folhas isoladas isoladas em placas de Petri, os insetos são mais fáceis de aplicar e monitorar durante o período relativamente curto de infestação contribuindo para dados de expressão genética reprodutível. Este protocolo pode ser adaptado a muitas interações vegetais/insetos.
se forem consideradas observações de linha de base de sistemas vegetais inteiros. A natureza imprevisível da alimentação de insetos pode ser desafiadora. Portanto, um suprimento confiável de larvas devidamente encenadas e plantas saudáveis proporcionam a melhor chance de sucesso.
Visualizar como plantas e insetos saudáveis devem aparecer e se comportar é fundamental para alcançar resultados ideais especialmente para pesquisadores novos no campo de estudo. Demonstrando o procedimento comigo estará Frances Perez, bióloga molecular no laboratório de melhoramento genético de frutas e vegetais. Para preparar plantas de batata de cultura de tecido propagada nodal, primeiro obtenha plantas kennebec cultivadas a partir de material explant com pelo menos três a quatro nodes.
Use uma lâmina estéril para remover as folhas que cortam os galhos próximos ao caule principal e deixando cerca de dois milímetros de tecido de galho por folha. Corte aproximadamente dois milímetros acima e abaixo de cada nó para remover as seções nodais das hastes e organizar as estacas nodais em um vaso de cultura tecidual estéril contendo meio de transferência nodal com o ramo apontando para cima. Em seguida, transfira os cortes nodais para uma câmara de cultura de tecido vegetal para duas a três semanas de crescimento a 24 graus Celsius e um período de 16 horas de luz, oito horas de foto escura.
Para preparar os insetos para alimentação, obtenha o estágio larval desejado de M.sexta e transfira uma larva para cada poço de um vaso de contenção adequado de acordo com o tamanho da larva. Faça modelos de colocação para cada ponto de tempo de colheita usando cinco bandejas resistentes capazes de segurar um conjunto de seis pratos petri de tamanho apropriado forrados com papel branco. Rastreie um conjunto de seis círculos usando a placa de Petri de tamanho apropriado no papel em cada bandeja e rotule um conjunto de círculos controle A, B e C e o outro infestado A, B e C.Em seguida, rotule cada modelo de colocação com o tempo de colheita apropriado.
Em seguida, rotule um tubo de microcentrifus de 1,7 mililitro para cada círculo no modelo de colocação para identificar adequadamente a perturbação, a letra de replicação da planta e o ponto de tempo de colheita. Quando todos os tubos tiverem sido rotulados, coloque um disco de papel filtro estéril em uma placa de Petri por modelo e umedeça os discos com água estéril sem deixar o excesso de piscina líquida em cada prato. Em seguida, coloque um prato em cada círculo em cada modelo de colocação e coloque três plantas de batata da mesma idade e tamanho relativo ao lado de cada modelo de colocação.
Para iniciar a infestação, use uma tesoura estéril para remover as folhas de dois tamanhos superiores de cada planta e coloque uma folha na placa de Petri de controle e uma na placa de Petri infestada para cada planta o mais rápido possível. Quando todas as folhas tiverem sido colocadas, use fórceps de toque macio para transferir pelo menos uma larva para cada prato infestado o mais rápido possível e definir o temporizador para o tempo de infestação desejado. Observe a alimentação para ter certeza de que todas as larvas estão comendo, substituindo quaisquer larvas que não se alimentam conforme necessário.
Retire todas as larvas de todas as folhas no final do tempo de infestação e inicie o temporizador para a colheita. No final de cada ponto de tempo de colheita, transfira cada folha para o tubo correspondente e solte imediatamente o tubo em nitrogênio líquido para congelar a amostra da folha antes de armazenar a menos 80 graus Celsius até o isolamento do RNA. Larvas saudáveis com precisão devem começar a se alimentar imediatamente após a colocação na superfície da folha e a alimentação deve continuar de forma bastante consistente durante o período de infestação.
A larva no fundo desta folha não consumiu nenhum material vegetal e é um exemplo de infestação mal sucedida. Essas folhas foram separadas de plantas de cultura de tecido propagado nodal de duas semanas de idade e consumidas em diferentes taxas e estilos de alimentação para cada estágio larval. Com base nesses resultados, foram selecionadas quartas larvas instar para avaliar ainda mais os danos às folhas para plantas de batata cultivadas mais maduras que mais aproximam as plantas de batata cultivadas em campo.
Nestes estudos de expressão genética, dois novos fatores de transcrição do dedo de zinco C2H2 que respondem robustamente à herbívora M.sexta foram identificados apoiando o uso de folhas separadas para ensaios de infestação. Lembre-se de usar as folhas combinadas de idade e tamanho e para encenar adequadamente as larvas para cada experimento, pois a uniformidade resulta em dados mais reprodutíveis. Os tecidos de folhas podem ser testados para espécies de oxigênio reativo induzidas pelo estresse e derivados hormonais ácidos jasmônicos.
Estudos de transcriptome, proteome ou microbioma completos também podem ser realizados nos tecidos da folha.
