Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся биогеохимического цикла кадмия и ртути, такие как, как различные экологические переменные влияют на их биодоступность бактерий. Основным преимуществом этого метода является то, что он предлагает квази в режиме реального времени биодоступности данных и жизнеспособных клеток, независимо от наличия кислорода. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что Есть много времени чувствительных шагов, которые требуют очень тщательного внимания к деталям.
Демонстрацией процедуры будет Бен, аспирант из моей лаборатории. Чтобы подготовиться к анализу, получить ртуть неодобренных биосенсор и constitutively выраженный биосенсор от минус 80 градусов по Цельсию крио запасов. Плита клеток на листогенный бульон пластин, содержащих 120 микрограммов на миллилитр ампициллина.
Выращиваем культуры пластин в инкубаторе при 37 градусах Цельсия за одну ночь. Между 4:30 и 5 p.m. привить культуру в десять миллилитров LB с ампициллином и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской при 220 об/мин.
В период между девятью и .m утра на следующее утро принести культуры, а также ранее подготовленных среднего роста в анаэробной камере. Затем добавьте восемь миллилитров свежей среды роста и 210 микрограммов на миллилитр ампициллина в стерильную трубку.
Теперь соберите два миллилитров ночной выращенной культуры и перенесите в двухми миллилитровую микро центрифугу трубки. После центрифугирования на 10 000 RCF в течение 90 секунд, удалить супернатант и повторно в два миллилитров свежей среды роста. Затем добавьте заново нажатую культуру в трубку, содержащую восемь миллилитров свежей среды роста и ампициллина.
Используя стерильную технику, аккуратно поместите резиновую пробку на трубку, прежде чем удалить ее из анаэробной камеры. Затем поместите трубку в инкубатор и расти анаэробически при 37 градусах по Цельсию с тряской при 220 об/мин. От трех до пяти .m.
принести балч трубки с культурой, новая стерильная трубка для бальзама, и рост среды в анаэробной камере. Добавьте 100 микролитров культуры в 10 миллилитров свежей среды роста с ампициллином в стерильной бальх-трубке. Используя стерильную технику, аккуратно поместите резиновую пробку на бальную трубку.
Удалите трубку из анаэробной камеры перед выращиванием его на ночь при 37 градусах по Цельсию при тряске при 220 об/мин. Между девятью и .m на следующий день, перенести культуру и среду роста обратно в анаэробную камеру.
Снова добавьте восемь миллилитров среднего роста и ампициллина в стерильную трубку. Перенесите два миллилитров ночной выращенной культуры в двухми миллилитровую микро центрифугу. После центрифугации, как и прежде, удалить супернатант и повторного перерасхода клеток в двух миллилитров свежей среды роста.
Затем добавьте заново спенированную культуру в трубку, содержащую свежий средний рост и ампициллин. Используя стерильную технику, аккуратно поместите резиновую пробку на бальную трубку. Удалить его из камеры и расти анаэробно при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 220 об/мин.
Мониторинг роста культуры с помощью спектрофотометра путем вихревого культуры, а затем измерения оптической плотности на 600 нанометров или OD600. После трех-четырех часов ожидаемого роста, культура должна достичь OD600 из 6. Теперь возьмите трубку в анаэробную камеру и перенесите культуру в две миллилитровые микро центрифуги.
После центрифугации, как и прежде, удалить супернатант и повторное течение каждой клетки неба в двух миллилитров свежей среды воздействия. Повторите этот шаг стирки один раз, чтобы удалить любой след среды роста. Теперь объединить обе микро центрифуги трубки клеточной культуры в семь миллилитров PTFE стандартный флакон для получения биосенсорного запаса для использования в анализе воздействия.
Перед началом эксперимента проверьте анаэробный монитор, чтобы убедиться, что в анаэробной камере нет кислорода. Дизайн макета пластины в соответствии с шаблоном 96 хорошо. Для запуска экспериментов в технических репликаций из трех это позволит 32 различных процедур, которые лучше всего представлены с четырьмя на восемь сетки для настройки флаконов.
Настройка сетки из четырех на восемь в соответствии с макетом анализной пластины. Затем поместите семь миллилитров стандартных флаконов PTFE в лоток. Флаконы должны обрабатываться только путем манипулирования внешней стороны флакона.
Добавьте средний объем экспозиции в каждый флакон, соответствующий каждому лечению. К каждому флакону добавить соответствующий объем химической переменной для тестирования в соответствии с расположением пластины. Теперь добавьте нитрат в каждый флакон так, чтобы концентрация 200 микромолеров.
Исключите этот шаг для составляющих биосенсорных заготовок для лечения. Чтобы добавить ртуть во флаконы, сначала возьмите от четырех до восьми микромоляных запасов и хорошо встряхните. Разбавить раствор и воздействия среды в семь миллилитров PTFE флакона в концентрации от 100 до 250 наномолярных сделать рабочий раствор ртути.
Из этого рабочего решения добавьте ртуть в необходимые флаконы в соответствии с макетом пластины. После добавления ртути или кадмия вручную встряхните пластину в орбитальном движении. Эксперимент может быть приостановлен в настоящее время в зависимости от времени, необходимого для ртути или кадмия, чтобы специатить в растворе.
Когда эксперимент возобновляется, осторожно пипетки биосенсора запас туда и обратно, чтобы обеспечить однородность. Затем добавьте 100 микролитров биосенсорного запаса к каждому флакону и вручную встряхните пластину, как раньше. Разогреть считыватель пластины до 37 градусов по Цельсию и создать кинетический запустить в течение десяти часов с читает каждые две точки пять-пять минут.
Орбитальная тряска между показаниями. Настройка запуска принять флуоресценции измерений с флуоресценции возбуждение 440 нанометров и выброс 500 нанометров. Теперь пипетка 200 микролитров от каждого флакона PTFE в четыре на восемь сетки в соответствующие скважины 96 пластины скважины.
Pipette туда и обратно пять раз перед передачей каждых 200 микролитров. Вместо того, чтобы отказаться от наконечника пипетки, оставьте наконечник пипетки в флаконе PTFE, чтобы отслеживать прогресс труб. Поместите 96 хорошо пластины в лоток пластины читателя.
Затем поместите крышку на 96 хорошо пластины и начать анализ. Вот репрезентативные результаты, показывающие исправленные данные о флуоресценции в качестве функции времени. Флуоресценция показана с увеличением концентрации ртути в неодобренном биосенсоре.
Все значения пусты для контроля ртути. Флуоресцентные пики можно количественно определить, чтобы показать флуоресцентный сигнал в качестве функции концентрации ртути или кадмия. Как для неискупленных, так и для составных биосенсоров для тестирования переменных следует использовать концентрацию ртути или кадмия в середине линейного диапазона неискушимых датчиков.
Вот примеры безрезультатного результата с цинком. И убедительный результат с магнием и марганцем на биодоступность ртути к биосенсору. Результат с цинком является неубедительным, потому что составной флуоресценции распадается с неудобовательной флуоресценцией, указывающей токсичности.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы войти в концентрации кадмия или ртути, поскольку они будут использоваться для калибровки биосенсора. Следуя этой процедуре, другие методы, такие как термодинамическое моделирование акальных систем, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, как конкретные химические виды ртути или кадмия влияют на их биодоступность. Не забывайте, что работа с кадмием и ртутью и сильными кислотами, такими как серная кислота, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как ношение средства индивидуальной защиты.
После его развития этот метод проложил путь для исследователей в области экологической микробиологии для изучения квази в режиме реального времени анаэробной ртути или кадмия биодоступности и генетически удобовательных микробов.
