Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bezüglich des biogeochemischen Zyklus von Cadmium und Quecksilber zu beantworten, wie z. B. wie verschiedene Umweltvariablen ihre Bioverfügbarkeit für Bakterien beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie quasi Echtzeit-Bioverfügbarkeitsdaten und lebensfähige Zellen bietet, unabhängig vom Vorhandensein von Sauerstoff. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil es viele zeitkritische Schritte gibt, die sehr sorgfältige Liebe zum Detail erfordern.
Demonstriert wird das Verfahren Ben, ein Grad Student aus meinem Labor. Um sich auf den Test vorzubereiten, holen Sie den quecksilberinduzierbaren Biosensor und den konstitutiv exprimierbaren Biosensor aus einem Kryobestand von minus 80 Grad Celsius ab. Die Zellen auf Lysogenesy-Brüheplatten mit 120 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.
Wachsen Sie die Plattenkulturen in einem Brutkasten bei 37 Grad Celsius über Nacht. Zwischen 16.30 und 17.m. impfen eine Kultur in zehn Millilitern LB mit Ampicillin und wachsen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 U/min.
Um neun und zehn .m am nächsten Morgen bringen die Kultur sowie das zuvor präparierte Wachstumsmedium in die anaerobe Kammer. Dann fügen Sie acht Milliliter frisches Wachstumsmedium und 210 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in ein steriles Balch-Rohr.
Sammeln Sie nun zwei Milliliter der über Nacht gewachsenen Kultur und übertragen Sie sie in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Nach der Zentrifugierung bei 10.000 RCF für 90 Sekunden, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium. Dann fügen Sie die resuspended Kultur auf die Balch Tube mit acht Milliliter frisches Wachstumsmedium und Ampicillin.
Mit steriler Technik, legen Sie vorsichtig einen Gummistopfen auf das Balchrohr, bevor Sie es aus der anaeroben Kammer entfernen. Dann legen Sie die Röhre in einen Inkubator und wachsen anaerob bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 U/min. Zwischen drei und fünf .m.
das Balchrohr mit der Kultur, einem neuen sterilen Balchrohr und dem Wachstumsmedium in die anaerobe Kammer zu bringen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Kultur zu 10 Milliliter frisches Wachstumsmedium mit Ampicillin in der sterilen Balch-Röhre hinzu. Mit steriler Technik, legen Sie vorsichtig einen Gummistopfen auf das Balchrohr.
Entfernen Sie das Rohr aus der anaeroben Kammer, bevor Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 U/min anbauen. Zwischen neun und zehn .m am nächsten Tag, übertragen Sie die Kultur und das Wachstumsmedium zurück in die anaerobe Kammer.
Fügen Sie wieder acht Milliliter Wachstumsmedium und Ampicillin in ein steriles Balchrohr. Zwei Milliliter der über Nacht gewachsenen Kultur in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Nach der Zentrifugation wie zuvor, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in zwei Milliliter frischem Wachstumsmedium wieder aus.
Dann fügen Sie die resuspended Kultur auf die Balch Tube mit dem frischen Wachstumsmedium und Ampicillin. Mit steriler Technik, legen Sie vorsichtig einen Gummistopfen auf das Balchrohr. Entfernen Sie es aus der Kammer und wachsen anaerob bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 Rpm.
Überwachen Sie das Wachstum der Kultur mit einem Spektralphotometer, indem Sie die Kultur wirbeln und dann die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600 messen. Nach drei bis vier Stunden erwarteten Wachstums sollte die Kultur eine OD600 von 6 erreichen. Nun die Röhre in die anaerobe Kammer bringen und die Kultur in zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhren übertragen.
Nach zentrifugieren wie zuvor entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie jeden Zellpalate in zwei Milliliter frisches Expositionsmedium. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal, um jede Spur des Wachstumsmediums zu entfernen. Kombinieren Sie nun beide Mikrozentrifugenröhren der Zellkultur in einer sieben Milliliter PTFE-Standard-Durchstechflasche, um den Biosensorbestand für den Expositionstest zu erhalten.
Überprüfen Sie vor Beginn des Experiments den anaeroben Monitor, um sicherzustellen, dass sich kein Sauerstoff in der anaeroben Kammer befindet. Entwerfen Sie das Plattenlayout nach einer 96-Gut-Vorlage. Um Experimente in technischen Replikationen von drei durchzuführen, ermöglicht dies 32 verschiedene Behandlungen, die am besten mit einem vier mal acht Raster dargestellt werden, um die Fläschchen einzurichten.
Richten Sie das Vier-mal-Acht-Raster entsprechend dem Assay-Platten-Layout ein. Legen Sie dann sieben Milliliter PTFE Standard-Fläschchen in das Tablett. Fläschchen sollten nur durch Manipulation der Außenseite der Durchstechflasche behandelt werden.
Fügen Sie das mittlere Belichtungsvolumen in jede Durchstechflasche ein, die jeder Behandlung entspricht. Zu jeder Durchstechflasche das entsprechende Volumen der zu prüfenden chemischen Variable entsprechend dem Plattenlayout hinzufügen. Fügen Sie nun Nitrat in jede Durchstechflasche, so dass die Konzentration 200 Mikromolar beträgt.
Schließen Sie diesen Schritt für konstitutive Biosensor-Behandlungsrohlinge aus. Um den Fläschchen Quecksilber hinzuzufügen, nehmen Sie zuerst die vier bis acht mikromolaren Bestände und schütteln Sie gut. Verdünnen Sie die Lösung und das Expositionsmedium in einer sieben Milliliter PTFE-Durchstechflasche auf eine Konzentration von 100 bis 250 Nanomolaren, um eine funktionierende Quecksilberlösung herzustellen.
Von dieser Arbeitslösung, fügen Sie Quecksilber zu den erforderlichen Fläschchen entsprechend der Platte Layout. Nach Zugabe des Quecksilbers oder Cadmiums schütteln Sie die Platte manuell in einer Orbitalbewegung. Das Experiment kann nun in Abhängigkeit von der Zeit angehalten werden, die für die Speziierung von Quecksilber oder Cadmium in Lösung erforderlich ist.
Wenn das Experiment wieder aufgenommen wird, sanft Pipette Biosensor Bestand hin und her, um Homogenität zu gewährleisten. Dann 100 Mikroliter des Biosensorbestands in jede Durchstechflasche geben und die Platte wie bisher manuell schütteln. Erwärmen Sie den Plattenleser auf 37 Grad Celsius und richten Sie einen kinetischen Lauf für zehn Stunden mit Lesungen alle zwei Punkte fünf bis fünf Minuten ein.
Ein Orbitalschütteln zwischen den Messwerten. Richten Sie den Lauf ein, um Fluoreszenzmessungen mit einer Fluoreszenzerregung von 440 Nanometern und einer Emission von 500 Nanometern durchzuführen. Nun pipette 200 Mikroliter aus jeder PTFE-Durchstechflasche in den vier mal acht Gittern in die entsprechenden Brunnen der 96-Wellplatte.
Pipette fünfmal hin und her, bevor je 200 Mikroliter übertragen werden. Anstatt die Pipettenspitze zu entsorgen, lassen Sie die Pipettenspitze in der PTFE-Durchstechflasche, um den Pipettierfortschritt zu verfolgen. Legen Sie die 96-Well-Platte in das Fach des Plattenlesers.
Dann legen Sie den Deckel auf die 96 Brunnenplatte und beginnen Sie den Test. Hier sind repräsentative Ergebnisse, die korrigierte Fluoreszenzdaten als Funktion der Zeit zeigen. Fluoreszenz wird mit zunehmenden Quecksilberkonzentrationen an den induzierbaren Biosensor gezeigt.
Alle Werte sind leer für die No-Quecksilber-Kontrolle. Die Fluoreszenzspitzen können quantifiziert werden, um das Fluoreszenzsignal in Abhängigkeit von Quecksilber- oder Cadmiumkonzentration anzuzeigen. Sowohl für den induzierbaren als auch für den konstitutiven Biosensor sollte die Quecksilber- oder Cadmiumkonzentration in der Mitte des induzierbaren Sensors linearer Bereich für die Prüfung von Variablen verwendet werden.
Hier sind Beispiele für ein ergebnisloses Ergebnis mit Zink. Und ein schlüssiges Ergebnis mit Magnesium und Mangan auf Quecksilber Bioverfügbarkeit für den Biosensor. Das Ergebnis mit Zink ist nicht schlüssig, da die konstitutive Fluoreszenz mit induzierbarer Fluoreszenz zerfällt, die auf Toxizität hindeutet.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Konzentrationen von Cadmium oder Quecksilber einzugeben, da diese verwendet werden, um den Biosensor zu kalibrieren. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die thermodynamische Modellierung wässriger Systeme durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie bestimmte chemische Arten von Quecksilber oder Cadmium ihre Bioverfügbarkeit beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Cadmium und Quecksilber und starken Säuren wie Schwefelsäure extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Umweltmikrobiologie, um quasi Echtzeit anaerobe Quecksilber- oder Cadmium-Bioverfügbarkeit und genetisch traktierbare Mikroben zu erforschen.
