שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי רכיבה על אופניים ביו-גכימיים של קדמיום וכספית כגון כיצד משתנים סביבתיים שונים משפיעים על הזמינות הביולוגית שלהם לחיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה נתונים מעין הזמינות הביולוגית בזמן אמת ותאים קיימא ללא קשר לנוכחות של חמצן. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי ישנם צעדים רגישים לזמן רב הדורשים תשומת לב קפדנית מאוד לפרטים.
להדגים את ההליך יהיה בן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתכונן לתדהמה, לאחזר את biosensor הכספית בלתי ניתנת לעיכול ואת biosensor מבוטא באופן מכפורי ממניה קריו מינוס 80 מעלות צלזיוס. צלחת התאים על צלחות מרק Lysogeny המכיל 120 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין.
לגדל את תרבות הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בין 4:30 ו 5 p.m. לחסן תרבות בעשרה מיליליטר של LB עם אמפיצילין לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 220 סל"ד.
בין תשע לעשר בבוקר.m הבא להביא את התרבות, כמו גם את מדיום הצמיחה שהוכן בעבר לתוך התא אנאירובי. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי ו-210 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין לצינור בלך סטרילי.
עכשיו לאסוף שני מיליליטר של תרבות לילה גדל ולהעביר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר. לאחר צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 90 שניות, להסיר את supernatant ו resuspend בשני מיליליטר של מדיום צמיחה טרי. לאחר מכן מוסיפים את התרבות המתווסכלת לצינור הבלך המכיל שמונה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי ואמפיצילין.
באמצעות טכניקה סטרילית, בזהירות למקם פקק גומי על צינור בלך לפני הסרתו מן התא אנאירובי. ואז למקם את הצינור לתוך אינקובטור לגדול אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 220 סל"ד. בין שלוש לחמש אחה.m.
להביא את צינור הבלך עם התרבות, צינור בלך סטרילי חדש, ואת מדיום הצמיחה לתוך התא אנאירובי. הוסף 100 microliters של התרבות ל 10 מיליליטר של מדיום צמיחה טרי עם אמפיצילין בצינור בלך סטרילי. בעזרת טכניקה סטרילית, מניחים בזהירות פקק גומי על צינור הבלך.
מוציאים את הצינור מהתא האנירובי לפני שמגדלים אותו בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-220 סל"ד. בין תשע לעשר בבוקר.m למחרת, להעביר את התרבות ואת מדיום הצמיחה בחזרה לתא אנאירובי.
שוב להוסיף שמונה מיליליטר של צמיחה בינונית ואמפיצילין לתוך צינור בלך סטרילי. מעבירים שני מיליליטר של התרבות הגדלה בן הלילה לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר. לאחר צנטריפוגה כמו קודם, להסיר את supernatant ולתלות את התאים בשני מיליליטר של מדיום צמיחה טרי.
לאחר מכן מוסיפים את התרבות המתווסכלת לצינור הבלך המכיל את מדיום הצמיחה הטרי ואמפיצילין. בעזרת טכניקה סטרילית, מניחים בזהירות פקק גומי על צינור הבלך. מוציאים אותו מהתא וגדלים באופן אנאירובי ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-220 סל"ד.
לפקח על הצמיחה של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי מערבולת התרבות ולאחר מכן מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר או OD600. לאחר שלוש עד ארבע שעות של צמיחה צפויה, התרבות צריכה להגיע OD600 של 6. עכשיו להביא את הצינור בתא אנאירובי ולהעביר את התרבות לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה מיקרו מיליליטר.
לאחר צנטריפוגה כמו קודם להסיר את supernatant ו resuspend כל חיך התא בשני מיליליטר של מדיום חשיפה טרי. חזור על שלב כביסה זה פעם אחת כדי להסיר כל זכר של מדיום הצמיחה. עכשיו לשלב את שני צינורות מיקרו צנטריפוגה של תרבות התא לתוך בקבוקון תקן PTFE שבעה מיליליטר כדי להשיג את מלאי biosensor לשימוש בהשגחה חשיפה.
לפני תחילת הניסוי לבדוק את הצג אנאירובי כדי להבטיח כי אין חמצן בתא אנאירובי. עצב את פריסת הלוח בהתאם לתבנית באר 96. כדי להריץ ניסויים בשכפולים טכניים של שלושה זה יאפשר 32 טיפולים שונים, אשר מיוצג בצורה הטובה ביותר עם רשת ארבע על שמונה כדי להגדיר את הבקבוקונים.
הגדר את רשת ארבע על שמונה בהתאם לפריסה של לוחית ההתנסויות. לאחר מכן מניחים שבעה בקבוקונים סטנדרטיים PTFE מיליליטר במגש. בקבוקונים צריכים להיות מטופלים רק על ידי מניפולציה החלק החיצוני של הבקבוקון.
מוסיפים את החשיפה לנפח בינוני לכל בקבוקון המתאים לכל טיפול. לכל בקבוקון להוסיף את הנפח המתאים של המשתנה הכימי להיבדק על פי פריסת הלוח. עכשיו להוסיף חנקתי לכל בקבוקון, כך הריכוז הוא 200 מיקרומולר.
אל תכלול שלב זה עבור ריקים טיפול biosensor מכוננים. כדי להוסיף כספית לבקבוקונים, תחילה לקחת את ארבעת עד שמונה מלאי micromolar ולנער היטב. לדלל את הפתרון ואת המדיום חשיפה בבקבוקון PTFE שבעה מיליליטר לריכוז של 100 כדי 250 nanomolar כדי להפוך פתרון כספית עובד.
מפתרון עבודה זה, הוסף כספית לבקבוקונים הנדרשים בהתאם למערך הלוח. לאחר הוספת הכספית או קדמיום ידני לנער את הצלחת בתנועה מסלולית. הניסוי עשוי להיות מושהה עכשיו בהתאם לזמן הנדרש עבור כספית או קדמיום כדי speciate בפתרון.
כאשר הניסוי מתחדש, בעדינות פימט biosensor מלאי הלוך ושוב כדי להבטיח הומוגניות. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מלאי הביו-סנסור לכל בקבוקון ונערו ידנית את הצלחת כבעבר. לחמם את קורא הלוח ל 37 מעלות צלזיוס ולהגדיר ריצה קינטית במשך עשר שעות עם קריאות כל שתי נקודות חמש עד חמש דקות.
מסלול רועד בין הקריאות. הגדר את הריצה לקחת מדידות פלואורסצנטיות עם גירוי פלואורסצנטי של 440 ננומטר ו פליטה של 500 ננומטר. עכשיו פיפטה 200 microliters מכל בקבוקון PTFE ברשת ארבע על שמונה לתוך בארות המתאימות של צלחת 96 באר.
פיפטה הלוך ושוב חמש פעמים לפני העברת כל 200 מיקרוליטר. במקום להשליך את קצה פיפטה, להשאיר את קצה פיפטה בבקבוקון PTFE כדי לעקוב אחר התקדמות pipetting. מניחים את צלחת 96 היטב לתוך המגש של קורא הלוח.
לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת 96 היטב ולהתחיל את הראיה. להלן תוצאות מייצגות המציגות נתוני פלואורסצנטיות מתוקנים כפונקציה של זמן. פלואורסצנטיות מוצגת עם ריכוזים הולכים וגדלים של כספית לביוסנסור הבלתי ניתן לעיכול.
כל הערכים ריקים לפקד ללא כספית. ניתן לכמת את הפסגות הפלואורסצנטיות כדי להראות את האות הפלואורסצנטי כפונקציה של ריכוז כספית או קדמיום. הן עבור biosensors בלתי ניתן לעיכול והן עבור biosensors מכווני, ריכוז כספית או קדמיום באמצע הטווח ליניארי חיישנים בלתי ניתנים לעיכול יש להשתמש לבדיקת משתנים.
להלן דוגמאות לתוצאה לא חד משמעית עם אבץ. ותוצאה חד משמעית עם מגנזיום ומנגן על הזמינות הביולוגית של כספית לביוסנסור. התוצאה עם אבץ אינה חד משמעית מכיוון שהנוהורסצנטיות המכוננית נרקבת עם פלואורסצנטיות בלתי ניתנת לחיסון המצביעה על רעילות.
בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להזין את הריכוזים של קדמיום או כספית כמו אלה ישמשו כדי לכייל את biosensor. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מידול תרמודינמי של מערכות מים כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד מינים כימיים ספציפיים של כספית או קדמיום משפיעים על הזמינות הביולוגית שלהם. אל תשכח כי עבודה עם קדמיום וכספית וחומצות חזקות כגון חומצה גופרתית יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה הסביבתית לחקור את הזמינות הביולוגית האנ אירובית או קדמיום בזמן אמת ואת המיקרואורגניזמים הניתנים להגנה גנטית.
