Изучение профилей кодирования соматической стимуляции на сердечные нейронные реакции в спинномозговом спинном роге крысы

Мы описываем протокол для спинальной многоканальной внеклеточной записи наряду с регистрацией сердечной функции и анализом заблокированных сердечко спинальных нейронов дорсального рога. Этот метод предлагает синхронизированную во времени структуру для изучения спинальных механизмов, лежащих в основе висцеральных функциональных изменений грудной клетки, вызванных иглоукалыванием.

Многие исследования показали, что электроакупунктура может быть полезна в лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, его механизм остается плохо изученным. Спинной рог грудного отдела позвоночника (SDH) играет важную роль в интеграции и модуляции соматических и висцеральных входов, которые в свою очередь могут влиять на сердечный контроль. В отличие от поясничной СДГ, которая была широко изучена, грудная СДГ менее изучена из-за сложности хирургического воздействия и стереотаксической фиксации. В этом исследовании мы предлагаем общий подход к одновременному мониторингу активности нейронов и сердечной функции, сочетая запись электрокардиограмм и микроэлектродных матриц. Кроме того, мы описываем, как идентифицировать нейроны, заблокированные сердцем, путем вычисления распределения частоты возбуждения нейронной активности синхронно с сердцебиением. Эта стратегия имеет большое значение для изучения корреляции между сердечно-сосудистой функцией и активностью нейронов, а также для понимания соматокардиального рефлекса, вызванного стимуляцией периферических нервов.

Иглоукалывание или стимуляция поверхности тела, как выдающаяся терапевтическая техника в рамках традиционной китайской медицины (ТКМ), работает путем стимуляции определенных областей на поверхности тела. Он способствует многоуровневой регуляции функций организма через регуляцию висцеральных функций через афферентные пути, центральную интеграцию и вегетативные эфферентные нервные механизмы. Центральное место в этой терапии занимает концепция, согласно которой целенаправленная стимуляция анатомически определенных акупунктурных точек вызывает системную физиологическую регуляцию. Растущие клинические данные подтверждают роль иглоукалывания в качестве дополнительного метода лечения сердечно-сосудистых заболеваний, с доказанной эффективностью как в первичной профилактике, так и в протоколах дополнительного лечения ^1,2.

Первичные афференты сенсорных нейронов преимущественно заканчиваются в спинальном дорсальном роге (SDH), соответственно, спинальные нейроны дорсального рога (SDHNs) играют решающую роль в интеграции и модуляции соматических входов ^3,4,5. Кроме того, SDHRN также получают сердечные афференты и передают висцеральную информацию спинальным симпатическим преганглионарным нейронам (SPN) для модуляции сердечно-сосудистой системы⁶. Заблокированные сердцем SPN расположены в латеральном углу грудного сегмента спинного мозга (T1-T5), при этом аксоны выступают на шейные или грудные ганглии и впоследствии иннервируют сердце через сердечный, средний и нижний нервы. В результате, грудной отдел спинного мозга играет решающую роль в интеграции и модуляции соматических и висцеральных входов, которые затем могут влиять на сердечный контроль. Таким образом, важно понять, как соматическая стимуляция регулирует сердечную функцию посредством модуляции SDHRN в грудном сегменте спинного мозга.

Предыдущие исследования показали, что электроакупунктура при РС6 (организованном в сегменте позвоночника Т3 как гомотопическая структурно-функциональная единица) может облегчить симптомы ишемии миокарда за счет модуляции вегетативной нервной системы ^7,8,9. Тем не менее, количественная синхронизация влияния иглоукалывания на частоту сердечных сокращений с активностью нервной системы в реальном времени еще не была реализована. Были задокументированы только непосредственные показатели вегетативной нервной деятельности и электрокардиограммы (ЭКГ) после иглоукалывания. Исследования, связывающие SDHN с висцеральными физиологическими функциями, остаются скудными. Из-за физиологического искривления грудных позвонков и узкого пространства между соседними грудными сегментами позвонков, особенно T1-T5, доступ к этим областям затруднен, что приводит к скудным прямым доказательствам для выяснения спинальных механизмов, лежащих в основе иглоукалывания в гомотопической акупунктурной точке PC6 Т3, регулирующей сердечную функцию при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

Чтобы лучше понять взаимосвязь между SDH и регуляцией сердечной функции, опосредованной иглоукалыванием, необходимо внедрить синхронную запись сердечной функции и нейронной активности. В этой статье мы представим общий подход к спинальной многоканальной внеклеточной записи наряду с регистрацией сердечной функции, а также анализируем SDHRN, заблокированные сердцем. Этот метод предлагает синхронизированную во времени структуру для изучения спинальных механизмов, лежащих в основе висцеральных функциональных изменений грудной клетки, вызванных иглоукалыванием.

Протокол эксперимента на животных строго соответствовал требованиям национального стандарта «Руководство по этической экспертизе благополучия лабораторных животных» (GB/T 35892-2018) и был утвержден Этическим комитетом учреждения. В этом исследовании использовались самцы крыс Sprague-Dawley (SD) SPF-класса в возрасте 6-8 недель и весом около 220 г. Во время всех экспериментов были надеты лабораторные халаты, перчатки и маски. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов. В конечной точке эксперимента крыс усыпляли с помощью перфузии сердца под глубокой анестезией с последующим вывихом шейки матки.

1. Предоперационная подготовка

1. Подключите контур аппарата ИВЛ к Y-образной эндотрахеальной трубке, обеспечив безопасное и герметичное соединение.
2. Проверьте правильность вентиляции, подтвердив стабильный поток воздуха, соответствующий дыхательный объем и настройки частоты дыхания на дисплее аппарата ИВЛ.
3. Убедитесь в отсутствии конденсата или твердых частиц внутри трубки, визуально осмотрев все сегменты при ярком освещении.
4. Одновременная подача усиленных сигналов ЭКГ на вход электрокардиографа и аналоговый входной порт системы записи микроэлектродной матрицы с помощью трехконтактного разъема BNC.
5. Направьте усиленные сигналы через трехполосный разветвитель BNC для одновременного подключения аналогового входа электрокардиографа и аналогового входного порта системы записи микроэлектродов.
6. Установите триггеры синхронизации, подключив выход TTL электрокардиографа к цифровому входу системы записи микроэлектродной матрицы. С помощью интерфейсного кабеля BNC-Dupont инициируйте одновременный сбор данных в обеих системах, проверяя временное выравнивание.

2. Предоперационная подготовка

1. Обезболивание
   1. Индуцируйте анестезию 3-5% изофлураном путем ингаляции, а затем введите внутрибрюшинную инъекцию пентобарбитала натрия (50 мг/кг) крысе, находящейся под наркозом. Вводите изофлуран для ингаляционной анестезии перед установкой электродов, поддерживая концентрацию ~1,2%. Действуйте только в том случае, если оцените глубину анестезии с помощью щипка пальца ноги перед тем, как продолжить.
   2. Удалите шерсть с передней части шеи и задней части спины крыс.
   3. Расположите крысу в лежачем положении на согревающем одеяле и нанесите мазь на глаза крысы, чтобы предотвратить высыхание. Наблюдайте за частотой дыхания и проверяйте реакцию на отход, надавливая щипцами на подушечку стопы.

3. Интубация трахеи

1. Поместите крыс в лежачее положение и продезинфицируйте область шеи йодной настойкой.
2. Выполните продольный разрез примерно на 1 см по средней линии шеи и тупо рассеките мышечную ткань.
3. Как только щитовидная железа обнажится, осторожно отделите тонкую мембрану между двумя долями щитовидной железы, стараясь не повредить ткань щитовидной железы. Приступайте к обнажению трахеи.
4. Осмотрите «Y-образную канюлю, чтобы убедиться, что она полностью сухая. С помощью пружинных ножниц сделайте поперечный разрез в трахее с последующим введением канюли в отверстие трахеи. Закрепите трахеальную канюлю нерассасывающимися нитями 3-0, чтобы предотвратить утечку воздуха и случайную экстубацию.
5. Тщательно зашить мышцы шеи и кожу и подключить крысу к аппарату искусственной вентиляции легких. Отрегулируйте частоту дыхания до 85 вдохов/мин и дыхательный объем до 3,5 мл в соответствии с массой тела крысы⁷ (рис. 1B).

4. Определение ЭКГ

1. Вставьте три электрода в кожу крысы: положительный электрод в левую нижнюю конечность, отрицательный электрод в правую верхнюю конечность и заземляющий электрод в правую нижнюю конечность¹⁰.
2. Получение данных с помощью электрокардиографа (настройки фильтра: низкочастотный на 100 Гц, высокочастотный на 1 кГц; частота дискретизации: 4 кГц/с). Используйте программное обеспечение для записи ЭКГ для записи, сохранения и анализа данных.

5. Перикардиальная катетеризация для введения препарата брадикинин (БК)

1. Поместите крысу в лежачее положение и продезинфицируйте кожу на груди йодом.
2. Выполните торакотомию между 1-м и 3-м реберными хрящами на левой верхней части грудной клетки, чтобы обнажить тимус. Тупо рассеките тимус по средней линии, чтобы обнажить перикард (см. рисунок 1C, D).
3. С помощью кончика стеклянной иглы для рассечения (0,5 мм в диаметре) сделайте небольшое отверстие в перикарде.
4. Через разрез в перикарде введите силиконовый катетер, длиной 10-15 см, с несколькими маленькими отверстиями на его дистальном конце. Закрепите катетер на ткани грудной стенки с помощью биоклея.
5. Закрывайте грудную полость слой за слоем, следя за тем, чтобы дыхание крысы оставалось беспрепятственным (см. рисунок 1D).

6. Обнажение Т3 спинного мозга

1. Поместите крысу в положение лежа и проведите обычную дезинфекцию йодом. Сделайте разрез примерно на 8 см по средней линии спины от позвонков Т2 до Т6.
2. Используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать кожу и мышечные слои, включая трапециевидную мышцу. Вставьте ретрактор между мышцами, чтобы еще больше обнажить операционное поле.
3. Осторожно отделите жировые железы и железы впадания в спячку в передней части грудных позвонков крысы, избегая кровеносных сосудов под железами (см. рисунок 1E).
4. Удалите мышцы, крепящиеся к головному зажиму, и прямую часть длинных мышц шеи, обнажив остистые отростки Т2.
5. Сместите полуостные и спинные мышцы, чтобы обнажить дугу позвонка от T2 до T6 (см. рисунок 1E). С помощью ронжеров удаляют остистый отросток позвонка Т3, тем самым обнажая спинной мозг Т3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе обнажения грудных позвонков особое внимание следует уделять сохранению остистого отростка Т2, так как он служит основной точкой приложения силы для последующего обнажения Т3 спинного мозга.
6. Удалите твердую мозговую оболочку и паутинную оболочку и капните парафиновое масло на поверхность спинного мозга для поддержания жизнеспособности спинномозговых нейронов (см. рисунок 1F).
   Кровеносные сосуды коричневой жировой ткани крысы берут начало в пластинке Т3, Т4 или Т5 и распределены подобно венозному синусу. Будьте осторожны, не прикасайтесь к ним, так как это может вызвать чрезмерную кровопотерю у крысы.

7. Фиксация и постановка грудных позвонков

1. Используйте специальный спинальный зажим для фиксации суставных отростков Т2 и Т6. Увлажните окружающие мышцы солевым раствором для поддержания увлажненности.
2. Присоедините электродную решетку к микроманипулятору стереотаксического инструмента и вставьте ее вертикально в дорсальный рог спинного мозга в точке Т3 спинномозгового сегмента через дорсальную срединную борозду, латерально 500 мкм от средней линии, на глубину 1 500 мкм.
3. Вставьте электрод сравнения в мышцу спины (см. рисунок 1G).
4. Запустите программное обеспечение для многоканальной внеклеточной записи и перейдите в раздел Файл | Конфигурация оборудования; Выберите 32-канальный массив из списка интерфейсов устройства; кликнуть правой кнопкой мыши по выбранной группе каналов; , а затем выберите «Свойства » в контекстном меню. Настройка параметров обработки сигнала: На вкладке Фильтр установите полосовой фильтр (БП) на 250 Гц - 5 кГц; в поле Частота дискретизации введите 30 кГц/с; Включите алгоритмы обнаружения спайков, установив флажок Включить обработку спайков , чтобы активировать сортировку пиков в реальном времени и извлечение событий на основе пороговых значений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное очищение мышц и тканей, окружающих суставные отростки Т2 и Т6, особенно в области, где для фиксации позвоночника применяется специальный спинальный зажим, чтобы предотвратить смещение во время последующих экспериментов.

8. Соматические и BK стимулы

1. Используйте BK (1 мкг/мл в дистиллированной воде) для стимуляции ноцицептивной стимуляции сердца. Ввести 4 мкл раствора БК с помощью микрошприца, подключенного к силиконовому катетеру с несколькими маленькими отверстиями¹¹.
2. Наблюдайте за изменениями частоты сердечных сокращений (увеличением или уменьшением) и выделением нейронов в Т3 спинного мозга дорсального рога в течение 30 минут после инъекции, чтобы определить динамические взаимодействия между нейронами заднего рога грудного отдела спинного мозга.
3. Проводят мануальную акупунктуру в акупунктурной точке PC6 (MAPC6) с использованием параметра стимуляции 1 Гц. PC6 (акупунктурная точка Нейгуана) расположена на 2 мм проксимальнее запястного сустава на вентральном предплечье, между лучевым сгибателем запястья и срединным нервным стволом. Вставьте иглы (0,25 мм x 25 мм) в акупунктурные точки PC6 на глубину ~3 мм. Сравните изменения нейронной активности и сердечной функции до и после соматических стимулов.

9. Анализ и обработка данных

1. Импортировать записанные нейронные данные в формате ns6 в программу можно следующим образом:
   1. Преобразование файла: Перейти к файлу | Откройте для загрузки файла ns6. Выбрать файл | Сохраните как и выберите формат .nex5 для создания стандартизированных данных о скачковой линии.
   2. Сортировка по шипам: импортируйте преобразованные файлы .nex5 в программное обеспечение для классификации нейронов. Сортировка пиковых сигналов на основе характеристик осциллограмм и анализа главных компонент (PCA) с пороговыми параметрами, установленными на уровне ±3 SD от базового шума.
   3. Затем выполните соответствующий код для фильтрации и категоризации сигналов.
2. Анализируйте SDRN, заблокированные сердцем.
   1. Взяв R-волну в качестве эталонного события, подсчитайте количество срабатываний нейронов в пределах 0,2 с до и после каждой R-волны.
   2. После подсчета R-волн с интервалом в 50 мс построим гистограмму кольцевого события. Нормализуйте гистограмму (т.е. вычтите среднюю скорость разряда за 0,2 секунды до и после события R-волны), чтобы получить распределение скорости разряда активности каждого нейрона во время сердцебиения.
   3. Оцените статистическую значимость с помощью теста перестановок по методу Монте-Карло¹² , реализованного с помощью 1 000 перетасованных итераций. Получить распределение частоты возбуждения и доверительный интервал нейрона в процессе рандомизированного сердцебиения путем рандомизации 0,2 с времени до и после каждого зубца R сердцебиения (диапазон составляет ± 0,1 с). Если распределение возбуждения сердечного ритма нейрона превышает (больше или меньше) 95% доверительный интервал распределения частоты возбуждения рандомизированного процесса сердцебиения, идентифицируйте нейрон как нейрон, заблокированный сердцем (см . Дополнительный файл 1).

В соответствии с вышеуказанным протоколом проводили воздействие T3 SDHNs, а в перикардиальные/акупунктурные области вводили брадикинин (BK) или соматическое иглоукалывание. В этом исследовании были количественно оценены профили активации нейронов, вызванные стимулом (т...

Расшифровка профилей кодирования нейронов SDH имеет важное значение для понимания нейромодулирующего механизма терапевтического воздействия иглоукалывания на висцеральную дисфункцию. Здесь мы объединили метод записи MEA in vivo с системой регистрации ЭКГ для одно?...

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Данное исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (No.82330127, No.82105029), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (No.2022YFC3500702) и Фондами фундаментальных исследований для Центральных научно-исследовательских институтов общественного благосостояния (No. ZZ-2023008) и проект Департамента образования провинции (No 2019JM-027).