Estudando os perfis de codificação da estimulação somática nas respostas neuronais cardíacas bloqueadas no corno dorsal espinhal de ratos

Descrevemos um protocolo para registro extracelular multicanal espinhal juntamente com o registro da função cardíaca e análise dos neurônios do corno dorsal espinhal bloqueados cardíacos. Este método oferece uma estrutura temporalmente sincronizada para estudar os mecanismos da coluna vertebral subjacentes às alterações funcionais viscerais torácicas induzidas pela acupuntura.

Muitos estudos sugeriram que a eletroacupuntura pode ser benéfica no tratamento e prevenção de doenças cardiovasculares. No entanto, seu mecanismo permanece pouco compreendido. O corno dorsal espinhal torácico (SDH) desempenha um papel importante na integração e modulação de entradas somáticas e viscerais, que podem influenciar o controle cardíaco. Em contraste com o HSD lombar, que tem sido extensivamente estudado, o HSD torácico tem sido menos explorado devido à dificuldade de exposição cirúrgica e fixação estereotáxica. Neste estudo, fornecemos uma abordagem geral para monitorar simultaneamente a atividade neuronal e a função cardíaca, combinando o registro de eletrocardiogramas e matrizes de microeletrodos. Além disso, descrevemos como identificar neurônios cardíacos bloqueados calculando a distribuição da taxa de disparo da atividade neuronal em sincronia com os batimentos cardíacos. A estratégia é de grande importância para o estudo da correlação entre a função cardiovascular e a atividade neuronal, bem como para a compreensão do reflexo somatocardíaco desencadeado por estímulos de nervos periféricos.

A acupuntura ou estimulação da superfície corporal, como uma técnica terapêutica proeminente no âmbito da Medicina Tradicional Chinesa (MTC), opera estimulando áreas específicas da superfície corporal. Facilita a regulação multinível das funções do organismo por meio da regulação das funções viscerais por meio de vias aferentes, integração central e mecanismos nervosos eferentes autônomos. Central para esta terapia é o conceito de que a estimulação direcionada de pontos de acupuntura anatomicamente definidos induz a regulação fisiológica sistêmica. Evidências clínicas crescentes apóiam o papel da acupuntura como uma modalidade complementar no tratamento de distúrbios cardiovasculares, com eficácia demonstrada tanto na prevenção primária quanto nos protocolos de tratamento adjuvante ^1,2.

Os aferentes primários dos neurônios sensoriais terminam predominantemente no corno dorsal espinhal (SDH), correspondentemente, os neurônios do corno dorsal espinhal (SDHNs) desempenham um papel crucial na integração e modulação das entradas somáticas ^3,4,5. Além disso, os SDHRNs também recebem aferências cardíacas e transmitem informações viscerais aos neurônios pré-ganglionares simpáticos espinhais (SPNs) para modulação cardiovascular⁶. Os NPS cardíacos bloqueados estão localizados no canto lateral do segmento torácico da medula espinhal (T1-T5), com axônios projetando-se para os gânglios cervicais ou torácicos e, subsequentemente, inervando o coração através dos nervos cardíaco, médio e inferior. Como resultado, a medula espinhal torácica desempenha um papel crucial na integração e modulação de entradas somáticas e viscerais, que podem influenciar o controle cardíaco. Assim, é importante entender como a estimulação somática regula a função cardíaca por meio da modulação dos SDHRNs no segmento torácico da medula espinhal.

Estudos anteriores demonstraram que a eletroacupuntura no PC6 (organizada no segmento espinhal T3 como uma unidade estrutura-função homotópica) pode aliviar os sintomas de isquemia miocárdica por meio da modulação do sistema nervoso autônomo ^7,8,9. No entanto, a sincronização quantitativa em tempo real dos efeitos da acupuntura na frequência cardíaca com a atividade do sistema nervoso ainda não foi realizada. Apenas a atividade nervosa autônoma imediata e os indicadores de eletrocardiograma (ECG) após a acupuntura foram documentados. Pesquisas que conectam SDHNs com funções fisiológicas viscerais permanecem escassas. Devido à curvatura fisiológica das vértebras torácicas e ao estreito espaço entre os segmentos vertebrais torácicos adjacentes, especialmente T1-T5, o acesso a essas áreas é um desafio, resultando em escassas evidências diretas para elucidar os mecanismos espinhais subjacentes à acupuntura no ponto de acupuntura homotópico espinhal T3 PC6 regulando a função cardíaca no tratamento de DCV.

Para entender melhor a relação entre SDH e regulação da função cardíaca mediada por acupuntura, o registro síncrono da função cardíaca e das atividades neurais precisa ser implementado. Aqui, forneceremos uma abordagem geral para o registro extracelular multicanal da coluna vertebral juntamente com o registro da função cardíaca, bem como a análise dos SDHRNs bloqueados cardíacos. Este método oferece uma estrutura temporalmente sincronizada para estudar os mecanismos da coluna vertebral subjacentes às alterações funcionais viscerais torácicas induzidas pela acupuntura.

O protocolo de experimentação animal seguiu rigorosamente os requisitos da norma nacional "Diretrizes para Revisão Ética do Bem-Estar de Animais de Laboratório" (GB/T 35892-2018) e foi aprovado pelo Comitê de Ética da instituição. Ratos machos da raça Sprague-Dawley (SD), com idade entre 6 e 8 semanas e pesando aproximadamente 220 g, foram utilizados neste estudo. Aventais de laboratório, luvas e máscaras foram usados durante todos os experimentos. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais. No desfecho do experimento, os ratos foram eutanasiados por meio de perfusão cardíaca sob anestesia profunda seguida de luxação cervical.

1. Configuração pré-operatória

1. Conecte o circuito do ventilador ao tubo endotraqueal em forma de Y, garantindo uma interface segura e hermética.
2. Verifique a ventilação adequada confirmando o fluxo de ar estável, o volume corrente apropriado e as configurações de frequência respiratória no visor do ventilador.
3. Garanta a ausência de contaminantes condensados ou particulados dentro da tubulação, examinando visualmente todos os segmentos sob iluminação forte.
4. Alimente simultaneamente os sinais de ECG amplificados na entrada do eletrocardiógrafo e na porta de entrada analógica do sistema de gravação de matriz de microeletrodos usando um conector BNC de três vias.
5. Encaminhe os sinais amplificados através de um divisor BNC de três vias para conectar simultaneamente a entrada analógica do eletrocardiógrafo e a porta de entrada analógica do sistema de gravação de matriz de microeletrodos.
6. Estabeleça gatilhos de sincronização conectando a saída TTL do eletrocardiógrafo à entrada digital do sistema de registro de matriz de microeletrodos. Usando um cabo de interface BNC para Dupont, inicie a aquisição simultânea em ambos os sistemas, verificando o alinhamento temporal.

2. Preparo pré-operatório

1. Anesthetization
   1. Induza a anestesia com isoflurano a 3-5% por inalação e, em seguida, administre uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg / kg) ao rato anestesiado. Administre isoflurano para anestesia inalatória antes de colocar os eletrodos, mantendo uma concentração de ~ 1,2%. Prossiga apenas se Avalie a profundidade da anestesia por meio de pinças antes de prosseguir.
   2. Remova o cabelo da parte anterior do pescoço e posterior das costas dos ratos.
   3. Posicione o rato em decúbito dorsal em um cobertor de aquecimento e aplique pomada nos olhos do rato para evitar o ressecamento. Observe a frequência respiratória e verifique as respostas de retirada aplicando pressão na almofada do pé com uma pinça.

3. Intubação traqueal

1. Coloque os ratos em decúbito dorsal e desinfete a área do pescoço com tintura de iodo.
2. Faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1 cm ao longo da linha média do pescoço e disseque sem corte o tecido muscular.
3. Uma vez que a glândula tireoide esteja exposta, separe cuidadosamente a fina membrana entre os dois lobos da tireoide, tomando cuidado para não danificar o tecido tireoidiano. Prossiga para expor a traqueia.
4. Examine a "cânula em forma de Y para confirmar se está completamente seca. Empregue uma tesoura de mola para fazer uma incisão transversal na traqueia, seguida da inserção da cânula na abertura traqueal. Prenda a cânula traqueal com suturas não absorvíveis 3-0 para evitar vazamento de ar e extubação acidental.
5. Suture cuidadosamente os músculos e a pele do pescoço e conecte o rato a um ventilador. Ajustar a frequência respiratória para 85 respirações/min e o volume corrente para 3,5 mL, de acordo com o peso corporal do rato⁷ (Figura 1B).

4. Detecção de ECG

1. Insira três eletrodos na pele do rato: o eletrodo positivo no membro inferior esquerdo, o eletrodo negativo no membro superior direito e o eletrodo terra no membro inferior direito¹⁰.
2. Adquira dados usando um eletrocardiógrafo (configurações de filtro: passa-baixa a 100 Hz, passa-alta a 1 kHz; frequência de amostragem: 4 kHz/s). Use o software de gravação de ECG para registrar, salvar e analisar dados.

5. Cateterismo pericárdico para administração de medicamentos bradicinina (BK)

1. Coloque o rato em decúbito dorsal e desinfete a pele do peito com iodo.
2. Realize uma toracotomia entre a 1ª e a 3ª cartilagens costais na parte superior esquerda do tórax para expor o timo. Dissecar o timo sem corte ao longo da linha média para expor o pericárdio (ver Figura 1C,D).
3. Use a ponta de uma agulha de dissecação de vidro (0,5 mm de diâmetro) para fazer uma pequena abertura no pericárdio.
4. Insira um cateter de silicone, de 10 a 15 cm de comprimento, com vários pequenos orifícios em sua extremidade distal através da incisão no pericárdio. Prenda o cateter ao tecido da parede torácica usando biocola.
5. Feche a cavidade torácica camada por camada, garantindo que a respiração do rato permaneça desobstruída (ver Figura 1D).

6. Exposição da medula espinhal T3

1. Coloque o rato em decúbito ventral e faça a desinfecção de rotina com iodo. Faça uma incisão de aproximadamente 8 cm ao longo da linha média das costas das vértebras T2 a T6.
2. Use uma tesoura de mola para cortar a pele e as camadas musculares, incluindo o músculo trapézio. Insira um afastador entre os músculos para expor ainda mais o campo cirúrgico.
3. Separe cuidadosamente as glândulas de gordura e hibernação na face anterior das vértebras torácicas do rato, evitando os vasos sanguíneos abaixo das glândulas (ver Figura 1E).
4. Remova os músculos ligados ao grampo de cabeça e a porção reta dos músculos longos do pescoço, expondo os processos espinhosos de T2.
5. Desloque os músculos semiespinhal e espinhal para expor o arco vertebral de T2 a T6 (ver Figura 1E). Use rongeurs para remover o processo espinhoso da vértebra T3, expondo assim a medula espinhal T3.
   NOTA: Durante o processo de exposição das vértebras torácicas, certifique-se de que seja dada atenção especial à preservação do processo espinhoso de T2, pois ele serve como o principal ponto de aplicação de força para a exposição subsequente da medula espinhal T3.
6. Remova a dura-máter e a membrana aracnóide e pingue óleo de parafina na superfície da medula espinhal para manter a viabilidade dos neurônios espinhais (ver Figura 1F).
   NOTA: Os vasos sanguíneos do tecido adiposo marrom do rato se originam na lâmina T3, T4 ou T5 e são distribuídos como um seio venoso. Tome cuidado para não tocá-los, pois isso pode causar perda excessiva de sangue no rato.

7. Fixação e configurações das vértebras torácicas

1. Use uma pinça espinhal personalizada para proteger os processos articulares de T2 e T6. Umedeça os músculos circundantes com solução salina para manter a hidratação.
2. Conecte o feixe de eletrodos ao micromanipulador de um instrumento estereotáxico e insira-o verticalmente no corno dorsal da medula espinhal no segmento espinhal T3 através do sulco mediano dorsal, 500 μm lateral à linha média, a uma profundidade de 1.500 μm.
3. Insira o eletrodo de referência no músculo das costas (consulte a Figura 1G).
4. Inicie o software de gravação extracelular multicanal e navegue até Arquivo | Configuração de hardware; selecione a matriz de 32 canais na lista de interface do dispositivo; clique com o botão direito do mouse no grupo de canais selecionado; e, em seguida, escolha Propriedades no menu de contexto . Configure os parâmetros de processamento de sinal: Na guia Filtro , defina o filtro passa-banda (BP) para 250 Hz - 5 kHz; no campo Taxa de amostragem , insira 30 kHz/s; habilite algoritmos de detecção de pico marcando a caixa rotulada Ativar processamento de pico para ativar a classificação de pico em tempo real e a extração de eventos baseada em limite.
   NOTA: Garanta a limpeza completa dos músculos e tecidos ao redor dos processos articulares de T2 e T6, especialmente na região onde a pinça espinhal personalizada é aplicada para fixação da coluna vertebral, para evitar o deslocamento durante os experimentos subsequentes.

8. Estímulos somáticos e BK

1. Use BK (1 μg / mL em água destilada) para induzir a estimulação nociceptiva cardíaca. Injete 4 μL da solução BK com uma microseringa conectada a um cateter de silicone com várias pequenas aberturas¹¹.
2. Observe as alterações da frequência cardíaca (aumenta ou diminui) e a descarga neuronal (aumenta ou diminui) no corno dorsal da medula espinhal T3 dentro de 30 minutos após a injeção para identificar interações dinâmicas entre os neurônios do corno dorsal da medula espinhal torácica.
3. Realize acupuntura manual no ponto de acupuntura PC6 (MAPC6) usando o parâmetro de estimulação de 1 Hz. PC6 (acupuntura Neiguan) está localizado 2 mm proximal à articulação do carpo no antebraço ventral, entre o flexor radial do carpo e o tronco nervoso mediano. Insira as agulhas (0.25 mm x 25 mm) nos pontos de acupuntura PC6 a uma profundidade de ~3 mm. Compare as mudanças na atividade neuronal e na função cardíaca antes e depois dos estímulos somáticos.

9. Análise e tratamento dos dados

1. Importe os dados neurais gravados no formato ns6 para o software da seguinte forma:
   1. Conversão de arquivo: Navegue até Arquivo | Abra para carregar o arquivo ns6. Selecione Arquivo | Salve como e escolha o formato .nex5 para gerar dados de trem de pico padronizados.
   2. Spike Sorting: Importe os arquivos .nex5 convertidos para o software de classificação para classificação neuronal. Classifique as formas de onda de pico com base nas características da forma de onda e na análise de componentes principais (PCA), com parâmetros de limite definidos em ±3 SD do ruído da linha de base.
   3. Em seguida, execute o código relevante para filtrar e categorizar os sinais.
2. Analise SDRNs cardíacos bloqueados.
   1. Tomando a onda R como evento de referência, conte o número de disparos de neurônios dentro de uma janela de 0,2 s antes e depois de cada onda R.
   2. Depois de contar as ondas R em intervalos de 50 ms, crie um histograma de evento de anel. Normalize o histograma (ou seja, subtraia a taxa média de descarga em 0,2s antes e depois do evento da onda R) para obter a distribuição da taxa de descarga da atividade de cada neurônio durante o batimento cardíaco.
   3. Avalie a significância estatística por meio do teste de permutação Monte Carlo¹² , implementado com 1.000 iterações embaralhadas. Obtenha a distribuição da taxa de disparo e o intervalo de confiança do neurônio no processo do batimento cardíaco randomizado randomizando 0,2 s do tempo antes e depois de cada onda R de batimento cardíaco (o intervalo é ± 0,1 s). Se a distribuição de disparo dos batimentos cardíacos de um neurônio exceder (maior ou menor que) o intervalo de confiança de 95% da distribuição da taxa de disparo do processo de batimentos cardíacos randomizado, identifique o neurônio como um neurônio cardíaco bloqueado (consulte o Arquivo Suplementar 1).

Seguindo o protocolo acima, os SDHNs T3 foram expostos, com bradicinina (BK) ou agulhamento somático administrado nas regiões pericárdicas/acupontos. Esta investigação quantificou os perfis de ativação neuronal evocados por estímulo (tipo/frequência) e alterações eletrocardiográficas (ECG) simultâneas durante a entrada visceral nociceptiva, aplicação de BK e modulação somatossensorial.

A Figura 2A mostra uma fatia...

A decodificação dos perfis de codificação neuronal do SDH é essencial para entender o mecanismo neuromodulador do efeito terapêutico induzido pela acupuntura na disfunção visceral. Aqui, combinamos a técnica de gravação in vivo MEA com o sistema de gravação de ECG para registrar simultaneamente a atividade de descarga dos SDHNs T3 e do ECG. A estimulação da dor cardíaca pode ativar nociceptores do tipo C que inervam o coração e transmitem informações nocicept...

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.82330127, No.82105029), pelo Programa Nacional de P&D da China (No.2022YFC3500702) e pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para os Institutos Centrais de Pesquisa de Bem-Estar Público (No. ZZ-2023008) e o Projeto do Departamento Provincial de Educação (nº 2019JM-027).