研究体细胞刺激对大鼠脊髓背角心脏锁定神经元反应的编码谱

我们描述了一种脊髓多通道细胞外记录以及心脏功能记录和分析心脏锁定的脊髓背角神经元的方案。该方法为研究针灸诱导的胸部内脏功能变化的脊柱机制提供了一个时间同步的框架。

许多研究表明，电针可能有益于治疗和预防心血管疾病。然而，其机制仍然知之甚少。胸椎背角 （SDH） 在整合和调节躯体和内脏输入方面起着重要作用，这可能会影响心脏控制。与已被广泛研究的腰椎 SDH 相比，由于手术暴露和立体定位固定的困难，胸部 SDH 的研究较少。在这项研究中，我们提供了一种通过结合心电图记录和微电极阵列来同时监测神经元活动和心脏功能的通用方法。此外，我们描述了如何通过计算与心跳同步的神经元活动的放电速率分布来识别心脏锁定的神经元。该策略对于研究心血管功能和神经元活动之间的相关性以及理解周围神经刺激触发的躯体心反射具有重要意义。

针灸或体表刺激作为传统中医 （TCM） 框架内的一种突出治疗技术，通过刺激体表的特定区域来运作。它通过传入通路、中枢整合和自主传出神经机制调节内脏功能，从而促进生物体功能的多层次调节。这种疗法的核心是这样一个概念，即对解剖学定义的穴位进行靶向刺激会诱导全身生理调节。越来越多的临床证据支持针灸作为治疗心血管疾病的补充方式，在一级预防和辅助治疗方案中均已证明有效 ^1,2。

感觉神经元的初级传入神经主要终止于脊髓背角 （SDH），相应地，脊髓背角神经元 （SDHNs） 在体细胞输入的整合和调节中起着至关重要的作用 ^3,4,5。此外，SDHRN 还接收心脏传入神经并将内脏信息传达给脊髓交感神经节前神经元 （SPN） 以进行心血管调节⁶。心脏锁定的 SPN 位于脊髓胸段 （T1-T5） 的外侧角，轴突突出到颈神经节或胸神经节，随后通过心脏、中神经和下神经支配心脏。因此，胸脊髓在躯体和内脏输入的整合和调节中起着至关重要的作用，这可能会影响心脏控制。因此，了解躯体刺激如何通过调节脊髓胸段的 SDHRN 来调节心脏功能非常重要。

先前的研究表明，PC6 电针（在 T3 脊髓段中组织为同位结构-功能单位）可以通过调节自主神经系统来缓解心肌缺血的症状 ^7,8,9。然而，针灸对心率影响与神经系统活动实时定量同步尚未实现。仅记录了针灸后即刻自主神经活动和心电图 （ECG） 指标。将 SDHN 与内脏生理功能联系起来的研究仍然很少。由于胸椎的生理弯曲和相邻胸椎节段之间的狭窄空间，尤其是 T1-T5，进入这些区域具有挑战性，导致缺乏直接证据来阐明针灸在 T3 脊髓同位穴位 PC6 调节心脏功能治疗 CVD 的脊柱机制。

为了更好地了解 SDH 与针灸介导的心脏功能调节之间的关系，需要实现心脏功能和神经活动的同步记录。在这里，我们将提供一种用于脊柱多通道细胞外记录以及心脏功能记录以及分析心脏锁定 SDHRN 的一般方法。该方法为研究针灸诱导的胸部内脏功能变化的脊柱机制提供了一个时间同步的框架。

动物实验方案严格遵守国家标准《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）的要求，并得到该机构伦理委员会的批准。本研究使用雄性 SPF 级 Sprague-Dawley （SD） 大鼠，年龄 6-8 周，体重约 220 g。在所有实验期间都穿着实验室长袍、手套和口罩。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。在实验结束时，大鼠在深度麻醉下通过心脏灌注实施安乐死，然后进行颈椎脱位。

1. 术前设置

1. 将呼吸机回路连接到 Y 形气管插管，确保接口安全、气密。
2. 通过在呼吸机显示屏上确认稳定的气流、适当的潮气量和呼吸频率设置来验证通风是否正确。
3. 通过在明亮的照明下目视检查所有段，确保管内没有冷凝物或颗粒污染物。
4. 使用三路 BNC 连接器，将放大的心电图信号同时馈送到心电图机输入和微电极阵列记录系统的模拟输入端口。
5. 将放大的信号路由通过三路 BNC 分配器，以同时连接心电图模拟输入和微电极阵列记录系统的模拟输入端口。
6. 通过将心电图仪的 TTL 输出连接到微电极阵列记录系统的数字输入来建立同步触发器。使用 BNC 到 Dupont 接口电缆，在两个系统上启动并发采集，验证时间对齐。

2. 术前准备

1. 麻醉
   1. 通过吸入用 3-5% 异氟醚诱导麻醉，然后，对麻醉大鼠腹膜内注射戊巴比妥钠 （50 mg/kg）。在放置电极之前施用异氟醚用于吸入麻醉，保持 ~1.2% 的浓度。只有在继续之前通过脚趾捏评估麻醉深度时，才继续。
   2. 去除大鼠前颈部和后背部的毛发。
   3. 将大鼠仰卧在温暖的毯子上，并在大鼠的眼睛上涂抹软膏以防止干燥。观察呼吸频率，并通过用镊子对脚垫施加压力来检查撤离反应。

3. 气管插管

1. 将大鼠置于仰卧位，并用碘酊对颈部进行消毒。
2. 沿颈部中线纵向切开约 1 厘米，并钝剖开肌肉组织。
3. 一旦甲状腺暴露出来，小心地将两个甲状腺叶之间的薄膜分开，注意不要损伤甲状腺组织。继续暴露气管。
4. 检查“Y 形套管”以确认它完全干燥。使用弹簧剪刀在气管上做一个横向切口，然后将套管插入气管开口。用 3-0 根不可吸收缝合线固定气管插管，以防止漏气和意外拔管。
5. 小心缝合颈部肌肉和皮肤，并将大鼠连接到呼吸机。根据大鼠的体重⁷ ，将呼吸频率调整为 85 次呼吸/分钟，潮气量为 3.5 mL（图 1B）。

4. 心电图检测

1. 将三个电极插入大鼠的皮肤：正极插入左下肢，负极插入右上肢，接地电极插入右下肢¹⁰。
2. 使用心电图仪采集数据（滤波器设置：100 Hz 的低通，1 kHz 的高通;采样频率：4 kHz/s）。使用 ECG 记录软件记录、保存和分析数据。

5. 用于药物给药的心包导管插入术缓激肽 （BK）

1. 将大鼠置于仰卧位，用碘对胸部皮肤进行消毒。
2. 在左上胸部的第一和第三肋软骨之间进行开胸手术，以暴露胸腺。沿中线钝剖解剖胸腺以露出心包（见 图 1C、D）。
3. 使用玻璃解剖针的尖端（直径 0.5 毫米）在心包上开一个小口。
4. 插入一根 10-15 厘米长的硅胶导管，其远端通过心包切口有几个小孔。使用 bioglue 将导管固定到胸壁组织上。
5. 逐层封闭胸腔，确保大鼠的呼吸畅通无阻（参见 图 1D）。

6. T3 脊髓暴露

1. 将大鼠置于俯卧位，并用碘进行常规消毒。沿着背部中线从 T2 到 T6 椎骨切开约 8 厘米。
2. 使用弹簧剪刀剪开皮肤和肌肉层，包括斜方肌。在肌肉之间插入牵开器以进一步暴露手术区域。
3. 小心地将大鼠胸椎前部的脂肪腺和冬眠腺分开，避开腺体下方的血管（见 图 1E）。
4. 去除附着在头夹上的肌肉和长颈肌肉的直线部分，露出 T2 的棘突。
5. 移位半脊肌和脊髓肌，露出从 T2 到 T6 的椎弓（见 图 1E）。使用咬骨去除 T3 椎骨的棘突，从而暴露 T3 脊髓。
   注意：在暴露胸椎的过程中，确保特别注意保留 T2 的棘突，因为它是随后暴露 T3 脊髓的主要受力点。
6. 去除硬脑膜和蛛网膜，将石蜡油滴在脊髓表面，以维持脊髓神经元的活力（见 图 1F）。
   注意：大鼠棕色脂肪组织的血管起源于 T3、T4 或 T5 层，分布像静脉窦一样。注意不要触摸它们，因为这可能会导致大鼠失血过多。

7. 胸椎固定和设置

1. 使用定制的脊柱夹固定 T2 和 T6 的关节突。用盐水润湿周围的肌肉以保持水分。
2. 将电极阵列连接到立体定向仪器的显微作器上，并通过中线外侧 500 μm 的背正中沟将其垂直插入 T3 脊髓段的脊髓背角，深度为 1,500 μm。
3. 将参比电极插入背部肌肉（参见 图 1G）。
4. 启动多通道细胞外记录软件并导航到 文件 |硬件配置;从 Device Interface 列表中选择 32 通道数组;右键单击选定的通道组;，然后从上下文菜单中选择 Properties （属性）。配置信号处理参数：在 Filter 选项卡下，将带通滤波器 （BP） 设置为 250 Hz - 5 kHz;在 Sampling Rate 字段中，输入 30 kHz/s;通过选中标记为 Enable Spike Processing 的框来启用尖峰检测算法，以激活实时尖峰排序和基于阈值的事件提取。
   注意：确保彻底清除 T2 和 T6 关节突周围的肌肉和组织，尤其是在使用定制脊柱夹进行脊柱固定的区域，以防止在后续实验中移位。

8. 躯体和 BK 刺激

1. 使用 BK（1 μg/mL 蒸馏水溶液）诱导心脏伤害性刺激。用微型注射器注射 4 μL BK 溶液，该注射器连接到具有几个小开口的硅胶导管¹¹。
2. 在注射后 30 分钟内观察 T3 脊髓背角的心率变化（增加或减少）和神经元放电（增加或减少），以确定胸脊髓背角神经元之间的动态相互作用。
3. 使用 1 Hz 的刺激参数在穴位 PC6 （MAPC6） 进行手动针灸。PC6（内关穴）位于前臂腹侧腕关节近端 2 毫米处，桡侧腕屈肌和正中神经干之间。将针头 （0.25 mm x 25 mm） 插入 PC6 穴位，深度为 ~3 mm。比较躯体刺激前后神经元活动和心脏功能的变化。

9. 数据分析和处理

1. 将记录的神经数据以 ns6 格式导入软件，如下所示：
   1. 文件转换：导航到 文件 |打开 以加载 ns6 文件。选择 “文件”|”另存为 并选择 .nex5 格式以生成标准化的尖峰序列数据。
   2. Spike Sorting：将转换后的 .nex5 文件导入分类软件进行神经元分类。根据波形特性和主成分分析 （PCA） 对尖峰波形进行排序，阈值参数设置为基线噪声的 ±3 SD。
   3. 然后，执行相关代码以筛选和分类信号。
2. 分析心脏锁定的 SDRN。
   1. 以 R 波为参考事件，计算每个 R 波前后 0.2 s 窗口内的神经元放电数量。
   2. 以 50 毫秒的间隔对 R 波进行计数后，创建一个环形事件直方图。归一化直方图（即，减去 R 波事件前后 0.2 秒的平均放电率）以获得心跳期间每个神经元活动的放电率分布。
   3. 通过 Monte Carlo¹² 排列测试评估统计显著性，该测试通过 1,000 次随机迭代实现。通过随机化每个心跳 R 波前后的 0.2 s 时间（范围为 ± 0.1 s），得到神经元在随机心跳过程中的放电率分布和置信区间。如果神经元心跳的放电分布超过（大于或小于）随机心跳过程的放电率分布的 95% 置信区间，则将神经元识别为心脏锁定神经元（参见 补充文件 1）。

按照上述方案，暴露 T3 SDHNs，对心包/穴区域施用缓激肽 （BK） 或体细胞针刺。这项研究量化了伤害感受内脏输入、BK 应用和体感调节过程中刺激诱发的神经元激活曲线（类型/频率）和并发心电图 （ECG） 变化。

图 2A 显示了大鼠 T3 脊髓的横向切片。在左侧，它说明了不同叶片的分布。右侧显示橙色区域，代表孵育 10 分钟后的 D...

解码 SDH 神经元编码谱对于理解针灸诱导的治疗效果对内脏功能障碍的神经调节机制至关重要。在这里，我们将 MEA 体内 记录技术与 ECG 记录系统相结合，同时记录 T3 SDHN 和 ECG 的放电活动。心脏疼痛刺激可以激活支配心脏的 C 型伤害感受器，并通过内脏、DRG、T1-T5 脊髓和脊髓向前传递伤害感受信息。交感神经传入纤维进入背角，传递到中间神经元，并投射到脊髓外...

作者没有需要声明的利益冲突。

本研究得到了国家自然科学基金（No.82330127， No.82105029）、国家重点研发计划（No.2022YFC3500702）和中央公益性科研院所基本科研业务费（No.82330127、No.82105029）的支持。ZZ-2023008）和省教育厅项目（编号 2019JM-027）。