ПЭТ/КТ с [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 для визуализации повреждений сухожилий в моделях травм ахиллова сухожилия крыс

В данной статье мы представляем протокол использования ПЭТ/КТ [⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 для демонстрации высокой чувствительности в выявлении и точной локализации повреждений сухожилий.

Травмы сухожилий, особенно поражающие ахиллово сухожилие, являются распространенными спортивными заболеваниями, которые значительно влияют на качество жизни пациентов. Несмотря на то, что существующие методы диагностики, такие как МРТ и УЗИ, широко используются, иногда они могут не давать точной патологической информации. Данное исследование было направлено на изучение возможности использования позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 для оценки экспериментальной модели травмы ахиллова сухожилия на крысе. Применение ПЭТ/КТ визуализации [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 продемонстрировало высокую чувствительность в выявлении и точной локализации повреждений сухожилий, обеспечивая более полное патологическое понимание по сравнению с традиционными методами визуализации. Активационный белок фибробластов (FAP), маркер активированных фибробластов, играет решающую роль в процессе восстановления сухожилий. Поглощение трассеров началось на стороне травмы/разрыва с первой недели после моделирования и достигло пика на второй неделе. Эти результаты показывают, что экспрессия FAP, активированная травмой и разрывом ахиллова сухожилия, достигла своего наивысшего уровня в течение второй недели процесса восстановления. Используя специфичность индикатора [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286, этот новый подход к визуализации точно визуализирует степень и прогрессирование повреждений сухожилий на животной модели.

Фибробласты повсеместно распределены почти по всем тканям и, как правило, находятся в состоянии покоя. При нарушении целостности тканей фибробласты активируются и мигрируют к месту повреждения, организуя процесс восстановления¹. После завершения восстановления фибробласты обычно возвращаются в состояние покоя; Однако в условиях хронического воспаления или фиброза они могут оставаться стойко активированными. FAP – это трансмембранный белок, экспрессируемый на поверхности активированных фибробластов. Недавние исследования продемонстрировали весьма многообещающий неинвазивный метод отслеживания FAP для выявления различных важных опухолевых образований, включая рак молочной железы, легких и колоректальный рак². Этот подход может быть дополнительно изучен на предмет его потенциала в диагностике травм сухожилий.

Травмы сухожилий представляют собой значительную проблему опорно-двигательного аппарата, составляющую примерно 30% всех консультаций по опорно-двигательному аппарату в общей^{врачебной} практике. Эти травмы распространены в различных возрастных группах и демографических группах, причем особенно высокая частота наблюдается среди лиц в возрасте 30 лет и старше, профессиональных групп, занимающихся повторяющимися движениями, и спортсменов. Примечательными примерами являются травмы вращательной манжеты плеча, разрывы ахиллова сухожилия, тендинопатия надколенника и теннисный локоть, каждая из которых демонстрирует различные показатели заболеваемости и пораженные популяции 4,5,6,7. Диагностические методы, такие как В-УЗИ и МРТ, обычно используются для оценки травм сухожилий. Однако, учитывая характерный процесс заживления сухожилий, включающий накопление фибробластов вокруг поверхности раны, было проведено исследование по изучению использования Al[¹⁸F]-NOTA-FAPI-04 для визуализации моделей травм сухожилий⁸. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что ПЭТ-КТ визуализация с FAPI может служить эффективным методом мониторинга прогресса заживления сухожилий и оценки тяжести травмы.

[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 обладает преимуществом специфического нацеливания на FAP в микроокружении опухоли с длительным временем удержания. В настоящее время он используется для визуализации опухолей. Насколько нам известно, ПЭТ/КТ с [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 не использовалась для визуализации повреждений сухожилий. Поэтому мы провели это исследование для изучения применения ПЭТ/КТ с [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 при визуализации повреждений сухожилий.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с этическими стандартами экспериментов на животных Первой аффилированной больницей Медицинской школы Чжэцзянского университета. (Номер ссылки: 20241008). ⁶⁸Ga – это радиоактивный элемент, который при распаде испускает позитроны, которые быстро соединяются с окружающими электронами, выделяя гамма-лучи. Гамма-лучи могут проникать через кожу, создавая риск радиационного повреждения организма. Весь экспериментальный персонал должен пройти обучение по радиационной безопасности и защите перед проведением соответствующих экспериментов. Во время экспериментов необходимо носить дозиметры радиации, экранирующие приборы и другие средства защиты. Радиоактивные отходы, образующиеся в ходе эксперимента, должны быть надлежащим образом утилизированы после проведения эксперимента.

1. Процесс подготовки и моделирования животных моделей

1. Подготовка
   1. Получить самцов крыс породы Спраг-Доули (SD) (возраст 6-8 недель, ~250 г ,n = 8). Акклиматизируйте их в стандартных лабораторных условиях с неограниченным доступом к пище и воде в течение 7 дней. С их помощью можно построить модели травмы и разрыва ахиллова сухожилия.
   2. Случайным образом разделите крыс на две группы: первая группа: модель повреждения ахиллова сухожилия (n = 4); вторая группа: модель травмы ахиллова сухожилия (n = 4).
2. Процесс моделирования
   1. Подготовьте инструменты: скальпель, кровоостанавливающие щипцы, стандартные щипцы, изофлуран, кислород, спиртовые тампоны, йодофор, фиксирующую пластину, хирургические швы, иглы.
   2. Обезболить крысу в индукционной камере смесью изофлурана и кислорода (1:1). Закрепите крысу без сознания на фиксирующей доске и поддерживайте анестезию с помощью противогаза, обеспечивающего непрерывную подачу изофлурана-кислорода.
   3. Хирургические инструменты простерилизовать спиртом и продезинфицировать операционное место.
   4. Установите модель травмы ахиллова сухожилия.
      1. Равномерно нанесите крем для депиляции на правую заднюю конечность, подождите 5 минут и удалите волосы с помощью бритвы.
      2. С помощью скальпеля сделайте продольный разрез, чтобы обнажить ахиллово сухожилие.
      3. Сжимайте сухожилие с помощью гемостатических щипцов до тех пор, пока оно не станет сплющенным.
      4. Закройте разрез швами.
   5. Установите модель разрыва ахиллова сухожилия.
      1. Выполните шаги 1.2.4.1 и 1.2.4.2, чтобы обнажить сухожилие Achilies.
      2. Захватите ахиллово сухожилие с помощью гемостатических щипцов и сделайте разрез по средней линии на всю толщину с помощью хирургических ножниц (Рисунок 1).
      3. Зашить разорванное сухожилие и закрыть разрез кожи.
   6. Следите за крысами на предмет признаков стресса и обеспечьте надлежащее заживление ран. Проведите ПЭТ-визуализацию через 1 неделю после операции.

2. Синтез ⁶⁸ Ga-NOTA-FAP2286

ПРИМЕЧАНИЕ: ⁶⁸Ga (период полураспада: 68 мин) получают из генератора ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga.

1. Приготовьте 50 мкг прекурсора, растворите его в 800 мкл безводного ацетонитрила и добавьте 3 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натрия для доведения рН до ~4. Разбавьте генератор ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga (5 мл/3 мин; убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха).
2. Наберите 5 мл 0,1 М соляной кислоты с помощью шприца с силикагелевым стержнем и введите соляную кислоту в генератор ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga для замены ⁶⁸Ga. Elute ⁶⁸Ga (∼17 mci) в стеклянный флакон объемом 10 мл
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте контакта соляной кислоты с металлом.
3. Смешайте растворенный прекурсор (NOTA-FAP-2286, регистрационный номер CAS: 2583823-71-4) и элюированную ⁶⁸Ga и поместите их в нагреватель при температуре 35 °C на 20 минут (реакция мечения показана на рисунке 2).
4. Чтобы очистить продукт, предварительно активируйте колонку C18 10 мл этанола и 10 мл воды. Поместите продукт на колонку C18 и промойте его 1 мл 50% этанола для получения конечного продукта.
5. Выпарите этанол. Нагрейте бутылку с готовым продуктом до 80 °C в течение ~20 минут, чтобы удалить избыток этанола из раствора путем выпаривания.
6. Проведите проверку контроля качества с помощью ВЭЖХ: Мобильная фаза: А (0,1% Н₃ПО₄ Водный раствор), 72%-52%, 0-20 мин; B (CH₃CN), 28%-48%, 0-20 мин; Расход: 3 мл/мин.

3. Визуализация мелких животных на ПЭТ

1. Закрепите крысу в удерживающем устройстве. Введение 500 μci из ⁶⁸GA-NOTA-FAP2286 через хвостовую вену крысам обеих групп.
2. Индуцировать анестезию с помощью изофлурана в индукционной камере.
3. Расположите полностью обезболенную крысу в поле сканирования так, чтобы ахиллово сухожилие находилось в центре поля сканирования (рис. 3).
4. Выполняйте сканирование ПЭТ мелких животных и получайте результаты визуализации.
   1. Включите компьютер, подключенный к системе PET для мелких животных. Нажмите на кнопку «Захват ТТ», чтобы начать процесс предварительного нагрева системы ТТ.
   2. После завершения предварительного нагрева выберите протокол сканирования и откройте соответствующий рабочий процесс сканирования (продолжительность сканирования предварительно установлена на 10 минут).
   3. Нажмите на Scout View , чтобы подтвердить расположение ахиллова сухожилия в центре поля сканирования. Если положение верное, нажмите «Начать рабочий процесс », чтобы выполнить сканирование ПЭТ и КТ.
      1. Используйте следующие параметры: вид кровати от NCT: 0-36,2-76,4 мм, время компьютерной томографии: 60 с/одна кровать. ПЭТ: Приобретается по времени: 600 с; Фотопиковый уровень энергии 511 КэВ; 350 кев Дискриминация на более низком уровне; Дискриминация верхнего уровня 650 КэВ; Временное окно 3,432 нс.
   4. После завершения сканирования нажмите « Реконструкция », чтобы восстановить файлы сканирования и получить результаты визуализации. Используйте Исследовательское рабочее место для постобработки изображений.

Мы успешно синтезировали [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 с выходом более 70% (с коррекцией распада), достигнув радиохимической чистоты более 95%. Профиль ВЭЖХ показан на рисунке 4. Хирургическим путем были установлены модели повреждений сухожилий, и внутривенно вводили [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 с последующей успешной ПЭТ-визуализацией мелких животных. Результаты представлены на рисунках 5, 6 и 7. Как показано на изображении ПЭТ (Рисунок 5), поглощение индикатора началось на поврежденной/разорванной стороне через 30 минут после инъекции и продолжало увеличиваться в течение следующих 90 минут, демонстрируя значительную разницу по сравнению с нормальным ахилловым сухожилием и мышечной тканью. Напротив, на рисунке 6 показано, что различие между поврежденным/разорванным ахилловым сухожилием и нормальным ахилловым сухожилием на изображениях КТ является сложной задачей. Изображение проекции максимальной интенсивности (MIP) на рисунке 7 показывает, что поглощение индикатора началось на поврежденной/сломанной стороне с первой недели после моделирования и достигло пика в течение второй недели, что указывает на то, что экспрессия FAP, активируемая травмой и разрывом ахиллова сухожилия, достигает своего наивысшего уровня в течение второй недели процесса восстановления. Конкретные значения внедорожника приведены в Таблице 1 и Таблице 2. Таблица 1 показывает, что через 30, 60 и 90 минут после инъекции максимальные и средние значения SUV на стороне перелома/травмы были значительно выше, чем у нормального ахиллова сухожилия и мышечной ткани, при этом статистическая значимость наблюдалась во всех трех временных точках. Таблица 2 также подтверждает, что в течение первых 3 недель значения SUV на стороне перелома/травмы отличались от значений на нормальной стороне и мышечной ткани, причем наиболее выраженная разница наблюдалась на второй неделе. Данные в таблицах 1 и 2 подтверждают результаты визуализации, изображенные на рисунках 5 и 7.

Рисунок 1: Модели ахиллова сухожилия крысы. (A) Модель травмы ахиллова сухожилия; (B) Модель разрыва ахиллова сухожилия. (В) Нормальное строение ахиллова сухожилия у крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Реакция маркировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Специальный метод фиксации для удержания ахиллова сухожилия крысы в центре поля сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Радиоактивная ВЭЖХ и ультрафиолетовый спектры [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Результаты ПЭТ-визуализации. Визуализация модели разрыва ахиллова сухожилия в (A) через 30 минут после инъекции, (B) через 60 минут после инъекции, (C) через 90 минут после инъекции. Визуализация модели травмы ахиллова сухожилия через (D) через 30 минут после инъекции, (E) через 60 минут после инъекции, (F) через 90 минут после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Результаты компьютерной томографии. Компьютерная томография разрыва ахиллова сухожилия через (А) 7 дней, (В) 14 дней, (В) 21 день. Компьютерная томография поврежденного ахиллова сухожилия через (D) 7 дней, (E) 14 дней, (F) 21 день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Результаты MIP ПЭТ-КТ визуализации. MIP ПЭТ-КТ визуализации разрыва ахиллова сухожилия через (А) 7 дней, (В) 14 дней, (В) 21 день. MIP ПЭТ-КТ визуализации поврежденного ахиллова сухожилия через (D) 7 дней, (E) 14 дней, (F) 21 день. Сокращение: MIP = проекция максимальной интенсивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Показатели SUV различных органов через 30, 60 и 90 минут после инъекции. Аббревиатура: SUV = стандартизированная величина поглощения.

Таблица 2: Значение SUV различных органов через 1, 2 недели и 3 недели после моделирования. Аббревиатура: SUV = стандартизированная величина поглощения.

На изображениях видны замечательные различия между правой и левой сторонами. ПЭТ-сканирование мелких животных наглядно иллюстрирует различия между нормальными и поврежденными/разорванными ахилловыми сухожилиями. Эти различия можно объяснить накоплением FAP на поврежденной/разорванной стороне, что приводит к повышенному поглощению визуализирующего агента. Эксперименты с визуализацией наряду с измерениями_{SUV max} и_{SUV mean} ясно демонстрируют контраст между поврежденным/разорванным ахилловым сухожилием и нормальным ахилловым сухожилием. Изменения в экспрессии FAP в процессе восстановления можно эффективно контролировать с помощью ПЭТ-визуализации.

Успех этого протокола зависит от нескольких важных шагов. Во-первых, первостепенное значение имеют подготовка и контроль качества радиоиндикатора [⁶⁸млрд лет]-NOTA-FAP-2286. Это включает в себя использование точных радиохимических методов для обеспечения высокой радиохимической чистоты и удельной активности. Во-вторых, точное индуцирование травм ахиллова сухожилия на моделях крыс имеет решающее значение для поддержания согласованности между субъектами. Стандартизированные хирургические методы и послеоперационный уход должны осуществляться в соответствии с установленными протоколами. В-третьих, определение оптимального времени для ПЭТ/КТ визуализации после травмы имеет важное значение для эффективного захвата наиболее информативных этапов процесса заживления. Для точного отслеживания прогрессии экспрессии FAP может потребоваться ряд временных точек. В-четвертых, необходимы тщательные протоколы получения и реконструкции изображений для максимизации как отношения сигнал/шум, так и пространственного разрешения, что может быть особенно сложно при исследованиях визуализации мелких животных⁹. Наконец, тщательный количественный анализ данных ПЭТ/КТ играет решающую роль в извлечении значимой информации о процессе заживления сухожилий; это включает в себя такие измерения, как внедорожник, и, возможно, анализ текстуры. Кроме того, радиоактивный индикатор демонстрирует быстрое поглощение и длительное удержание в опухолях.

Для оптимизации протокола можно рассмотреть несколько модификаций и стратегий устранения неполадок. Для достижения оптимального соотношения сигнал/шум может потребоваться корректировка дозы радиоактивного индикатора или временных точек визуализации, уравновешивая достаточное поглощение с минимальным фоновым сигналом. Уточнение модели травмы сухожилия имеет важное значение для обеспечения согласованности между субъектами, возможно, за счет стандартизации силы, прилагаемой при травмах от раздавливания, или степени разрыва. Внедрение методов коррекции движений может иметь решающее значение при визуализации мелких животных для минимизации артефактов, вызванных дыхательными или другими непроизвольными движениями. Изучение альтернативных алгоритмов реконструкции изображений, включая методы итерационной реконструкции, обещает повысить пространственное разрешение и количественную точность. Кроме того, включение динамической ПЭТ-визуализации может обеспечить более глубокое понимание кинетики поглощения [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 в поврежденных сухожилиях, тем самым предоставляя более полную информацию о процессе заживления. NOTA-FAP-2286 также продемонстрировал значительный потенциал в диагностике и лечении различных заболеваний, в частности ортопедических состояний¹⁰. При злокачественных и доброкачественных опухолях костей, таких как остеосаркома и метастатические опухоли костей, NOTA-FAP-2286 обладает высокой специфичностью к FAP, что позволяет проводить точную визуализацию ПЭТ/КТ и терапевтические приложения^. Кроме того, при воспалительных и фиброзных состояниях, таких как фиброз суставов, нарушения заживления переломов и артрит, NOTA-FAP-2286 дает ценную информацию о патологических процессах^{и активности заболевания}.

Несмотря на инновационность, этот метод имеет ряд ограничений. Пространственное разрешение ПЭТ-визуализации, обычно составляющее от 1 мм до 2 мм для сканеров мелких животных, может ограничивать возможность обнаружения незначительных изменений в заживлении сухожилий, особенно на ранних стадиях или при небольших^{поражениях}. Существует потенциальный риск поглощения неспецифических радиоактивных индикаторов в окружающих тканях, что может затруднить интерпретацию результатов, особенно в сложных анатомических областях. Более того, потребность в специализированном оборудовании и знаниях в области радиохимии и визуализации мелких животных может ограничить его широкое распространение. Перенос результатов с моделей крыс в приложения на людях представляет собой проблему из-за различий в размере сухожилий, процессах заживления и масштабах травм. Кроме того, хотя лучевая нагрузка, связанная с визуализацией ПЭТ, минимальна, она может ограничивать частоту продольных исследований на одном и том же животном.

Значение ПЭТ/КТ-визуализации, нацеленной на FAP, заключается в ее потенциале для обеспечения специфической и чувствительной визуализации процессов заживления сухожилий на молекулярном уровне⁹. По сравнению с традиционными методами визуализации, такими как МРТ или УЗИ, этот метод дает уникальное представление об активации фибробластов, важнейшем процессе заживления сухожилий. Это позволяет количественно оценить прогрессирование заживления с течением времени, потенциально способствуя более раннему выявлению аномалий или осложнений в процессе заживления. В отличие от других ПЭТ-индикаторов, таких как [^18F]-FDG, который в первую очередь отражает метаболизм глюкозы, [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 специально нацелен на FAP, тем самым предоставляя более точную информацию о фибробластической реакции во время восстановления сухожилия. Эта специфичность повышает способность различать нормальное заживление и патологические процессы, что приводит к более точной характеристике поражения.

Значение этого метода в исследованиях травм сухожилий многогранно. Он обеспечивает неинвазивный подход к мониторингу процессов заживления сухожилий в доклинических исследованиях, облегчая продольную оценку без необходимости повторной биопсии или жертвоприношения животных в различные моменты времени. Это не только значительно сокращает количество животных, необходимых для исследований, но и дает более согласованные данные. Кроме того, этот метод является перспективным для оценки новых терапевтических вмешательств при травмах сухожилий, предлагая количественную меру эффективности лечения. Кроме того, он может сыграть важную роль в исследовании молекулярных механизмов, лежащих в основе восстановления и регенерации сухожилий, потенциально выявляя новые терапевтические мишени. Особенно интересным является его потенциальное применение в клинической практике, поскольку он может улучшить диагностику и лечение травм сухожилий у людей. В области ортопедических исследований, спортивной медицины и регенеративной медицины этот метод визуализации может стать мощным инструментом для понимания и оптимизации стратегий, связанных с заживлением сухожилий, что в конечном итоге приведет к улучшению результатов лечения пациентов.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Исследование финансировалось Чжэцзянской программой медицинских наук и технологий (грант No 2023KY694), Чжэцзянским фондом естественных наук (номер гранта: LTG23H180014).