쥐 아킬레스건 부상 모델의 힘줄 부상 영상을 위한 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286이 있는 PET/CT

여기에서는 [⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 PET/CT 이미징을 활용하여 힘줄 손상을 감지하고 정확하게 위치를 파악하는 데 높은 감도를 나타내는 프로토콜을 제시합니다.

힘줄 부상, 특히 아킬레스건에 영향을 미치는 부상은 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미치는 일반적인 스포츠 관련 질환입니다. MRI, 초음파 등 기존의 진단법이 널리 사용되고 있지만, 정확한 병리학적 정보를 제공하지 못하는 경우가 있습니다. 본 연구는 아킬레스건 손상의 실험적 쥐 모델을 평가하기 위해 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영(PET/CT) 이미징을 사용하는 타당성을 조사하는 것을 목표로 했습니다. [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 PET/CT 영상의 적용은 힘줄 부상을 감지하고 정확하게 위치를 파악하는 데 높은 감도를 보여주었으며 기존 이미징 기술에 비해 보다 포괄적인 병리학적 통찰력을 제공했습니다. 활성화된 섬유아세포의 표지자인 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 힘줄 복구 과정에서 중요한 역할을 합니다. 트레이서 활용은 모델링 후 첫 주부터 부상/파열 측면에서 시작되어 두 번째 주에 최고조에 달했습니다. 이러한 결과는 아킬레스건 손상 및 파열로 활성화된 FAP 발현이 복구 과정의 두 번째 주에 가장 높은 수준에 도달했음을 보여줍니다. 이 새로운 이미징 접근 방식은 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 트레이서의 특이성을 활용하여 동물 모델에서 힘줄 손상의 정도와 진행을 정확하게 시각화합니다.

섬유아세포는 거의 모든 조직에 널리 분포되어 있으며 일반적으로 정지 상태로 존재합니다. 조직의 완전성이 파괴되면 섬유아세포가 활성화되어 손상 부위로 이동하여 복구 과정을 조율합니다¹. 복구가 완료되면 섬유아세포는 일반적으로 정지 상태로 되돌아갑니다. 그러나 만성 염증이나 섬유증 상태에서는 지속적으로 활성화된 상태로 유지될 수 있습니다. FAP는 활성화된 섬유아세포의 표면에서 발현되는 막관통 단백질입니다. 최근 연구에서는 유방암, 폐암, 대장암을 포함한 다양한 중요한 종양 개체를 식별하기 위해 FAP를 추적하는 매우 유망한 비침습적 방법을 입증했습니다². 이 접근 방식은 힘줄 부상을 진단할 수 있는 잠재력에 대해 더 자세히 탐구할 수 있습니다.

힘줄 부상은 중대한 근골격계 질환으로, 일반 진료에서 모든 근골격계 관련 상담의 약 30%를 차지합니다³. 이러한 부상은 다양한 연령대와 인구 통계에 걸쳐 널리 퍼져 있으며, 30세 이상의 개인, 반복적인 동작에 종사하는 직업 그룹 및 운동선수에서 특히 더 높은 발생률을 보입니다. 주목할 만한 예로는 회전근개 부상, 아킬레스건 파열, 슬개건병증, 테니스 엘보 등이 있으며, 각각 뚜렷한 발병률을 보이며 영향을 받은 인구 ^4,5,6,7. B-초음파 및 MRI와 같은 진단 방식은 일반적으로 힘줄 부상을 평가하는 데 사용됩니다. 그러나 상처 표면 주위에 섬유아세포가 축적되는 힘줄의 특징적인 치유 과정을 감안하여 힘줄 손상 모델⁸ 이미징에 Al[¹⁸F]-NOTA-FAPI-04를 사용하는 방법을 조사하기 위한 연구가 수행되었습니다. 이 연구 결과는 FATI를 사용한 PET-CT 영상이 힘줄 치유 진행 상황을 모니터링하고 부상의 심각성을 평가하는 효과적인 방법이 될 수 있다는 가설을 뒷받침합니다.

[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286은 보유 시간이 길어진 종양 미세환경에서 FAP를 특이적으로 표적으로 하는 이점을 제공합니다. 현재 종양 영상에 사용되고 있습니다. 우리가 아는 한, [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286이 있는 PET/CT는 힘줄 손상 영상에 사용되지 않았습니다. 따라서 힘줄 손상 영상에서 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286과 함께 PET/CT의 적용을 조사하기 위해 이 연구를 수행했습니다.

모든 동물 실험은 저장대학교 의과대학 제1부속병원의 동물실험에 대한 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. (참조 번호: 20241008). ⁶⁸의Ga는 붕괴할 때 양전자를 방출하는 방사성 원소로, 주변 전자와 빠르게 결합하여 감마선을 방출합니다. 감마선은 피부를 관통하여 신체에 방사선 손상을 줄 위험이 있습니다. 모든 실험 인력은 관련 실험을 수행하기 전에 방사선 안전 및 보호 교육을 받아야 합니다. 실험하는 동안 방사선 선량계, 차폐 기기 및 기타 보호 장비를 착용해야 합니다. 실험에서 생성된 방사성 폐기물은 실험 후 적절하게 처리해야 합니다.

1. 동물모델의 준비 및 모델링 과정

1. 준비
   1. 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐(6-8주, ~250g, n = 8)를 얻습니다. 표준 실험실 조건에서 7일 동안 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다. 이를 사용하여 아킬레스건 손상 및 파열 모델을 설정할 수 있습니다.
   2. 쥐를 무작위로 두 그룹으로 나눕니다: 그룹 1: 아킬레스건 부상 모델(n = 4); 그룹 2: 아킬레스건 부상 모델(n = 4).
2. 모델링 프로세스
   1. 메스, 지혈 겸자, 표준 겸자, 이소플루란, 산소, 알코올 면봉, 요오드포, 고정 플레이트, 외과용 봉합사 및 바늘과 같은 기구를 준비합니다.
   2. 이소플루란-산소 혼합물(1:1)로 유도실에서 쥐를 마취합니다. 의식을 잃은 쥐를 고정 보드에 고정하고 이소플루란-산소를 지속적으로 공급하는 방독면을 사용하여 마취를 유지합니다.
   3. 알코올로 수술 기구를 소독하고 수술 부위를 소독합니다.
   4. 아킬레스건 부상 모델을 수립합니다.
      1. 오른쪽 뒷다리에 제모 크림을 골고루 바르고 5분 정도 기다렸다가 면도기로 털을 제거합니다.
      2. 메스를 사용하여 아킬레스건을 노출시키기 위해 세로로 절개합니다.
      3. 지혈 겸자를 사용하여 힘줄이 평평해질 때까지 힘줄을 압박합니다.
      4. 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다.
   5. 아킬레스건 파열 모델을 확립합니다.
      1. 1.2.4.1 및 1.2.4.2 단계에 따라 Achilies 힘줄을 노출시킵니다.
      2. 지혈 겸자를 사용하여 아킬레스건을 잡고 수술 가위를 사용하여 전체 두께의 정중선 절개를 만듭니다(그림 1).
      3. 절단된 힘줄을 봉합하고 절개 부위를 봉합합니다.
   6. 쥐에게 고통의 징후가 있는지 모니터링하고 적절한 상처 치유를 확인하십시오. 수술 1주일 후에 PET 이미징을 수행합니다.

2. ⁶⁸ Ga-NOTA-FAP2286의 합성

참고: ^68Ga(반감기: 68분)는 ^67Ge/^68Ga발전기에서 얻습니다.

1. 전구체 50μg을 준비하고 무수 아세토니트릴 800μL에 용해시킨 후 0.1M 아세트산나트륨 완충액 3mL를 첨가하여 pH를 ~4로 조정합니다. ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga 발생기를 용리합니다(5mL/3분, 주사기에 기포가 없는지 확인).
2. 실리카겔 헤드 주사기를 사용하여 0.1M 염산 5mL를 추출하고 염산을 ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga 발생기에 주입하여 ⁶⁸Ga를 교체합니다. ⁶⁸Ga (∼17 mci)를 10 mL 유리 바이알로 용리합니다.
   알림: 염산과 금속의 접촉을 피하십시오.
3. 용해된 전구체(NOTA-FAP-2286, CAS 등록 번호: 2583823-71-4)와 용출된 ^68Ga를 혼합하고 35°C의 히터에 20분 동안 놓습니다(라벨링 반응은 그림 2에 나와 있음).
4. 제품을 정제하려면 10mL의 에탄올과 10mL의 물로 C18 컬럼을 사전 활성화합니다. 생성물을 C18 컬럼에 놓고 50% 에탄올 1mL로 헹구어 최종 생성물을 얻습니다.
5. 에탄올을 증발시킵니다. 최종 제품 병을 80 ° C에서 ~ 20 분 동안 가열하여 증발에 의해 용액에서 과도한 에탄올을 제거합니다.
6. HPLC를 사용하여 품질 관리 검사를 수행합니다 : 이동상 : A (0.1 % H₃PO₄ 수용액), 72 % -52 %, 0-20 분; B (CH₃CN), 28%-48%, 0-20분; 유속: 3mL/분

3. 작은 동물 PET 이미징

1. 쥐를 구속기에 고정하십시오. 꼬리 정맥을 통해 ⁶⁸GA-NOTA-FAP2286 500μci를 두 그룹의 쥐에 투여합니다.
2. 유도실에서 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다.
3. 완전히 마취된 쥐를 아킬레스건이 스캐닝 필드의 중앙에 있도록 스캐닝 필드에 배치합니다(그림 3).
4. 작은 동물 PET 스캔을 수행하고 이미징 결과를 얻습니다.
   1. 작은 동물 PET 시스템에 연결된 컴퓨터를 켭니다. CT Acquisition 을 클릭하여 CT 시스템의 예열 프로세스를 시작합니다.
   2. 예열이 완료되면 스캔 프로토콜을 선택하고 해당 스캔 워크플로를 엽니다( 스캔 시간은 10분으로 사전 설정됨).
   3. Scout View를 클릭하여 스캐닝 필드 중앙에 있는 아킬레스 건의 위치를 확인합니다. 위치가 올바르면 워크플로우 시작을 클릭하여 PET 및 CT 스캔을 수행합니다.
      1. NCT 침대 보기: 0-36.2-76.4mm, CT 스캔 시간: 60초/침대 1개를 사용합니다. PET: 시간까지 획득: 600초; 511 KeV Photopeak 에너지 준위; 350 Kev 낮은 수준의 차별; 650 KeV 상위 수준 차별; 3.432ns 타이밍 창.
   4. 스캔이 완료된 후 Reconstruction(재구성 )을 클릭하여 스캔 파일을 재구성하고 이미징 결과를 얻습니다. Research Workplace 를 사용하여 이미지를 후처리합니다.

[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286을 70% 이상(붕괴 보정)의 수율로 성공적으로 합성하여 95%를 초과하는 방사성 화학적 순도를 달성했습니다. HPLC 프로파일은 그림 4에 나와 있습니다. 힘줄 손상 모델을 외과적으로 확립하고 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286을 정맥 주사한 후 성공적인 소동물 PET 이미징을 수행했습니다. 결과는 그림 5, 그림 6 및 그림 7에 나와 있습니다. PET 이미지(그림 5)에서 볼 수 있듯이, 주사 후 30분 시점에 부상/파열된 쪽에서 추적자 흡수가 시작되어 이후 90분 동안 계속 증가하여 정상 아킬레스건 및 근육 조직과 비교하여 상당한 차이를 보였습니다. 이와는 대조적으로, 그림 6 은 CT 이미지에서 부상/파열된 아킬레스건과 정상 아킬레스건을 구별하는 것이 어렵다는 것을 보여줍니다. 그림 7 의 MIP(Maximum Intensity Projection) 이미지는 모델링 후 첫 주부터 부상/파손 쪽에서 트레이서 흡수가 시작되어 두 번째 주에 최고조에 달했음을 보여주며, 이는 아킬레스건 손상 및 파열로 인해 활성화되는 FAP 발현이 복구 프로세스의 두 번째 주에 가장 높은 수준에 도달함을 나타냅니다. 구체적인 SUV 값은 표 1과 표 2에 나와 있습니다. 표 1은 주사 후 30분, 60분, 90분에서 골절/부상 측의 최대 및 평균 SUV 값이 정상 아킬레스건 및 근육 조직보다 유의하게 높았으며, 세 시점 모두에서 통계적 유의성이 관찰되었음을 나타냅니다. 표 2는 초기 3주 동안 골절/부상 측의 SUV 값이 정상 측 및 근육 조직의 SUV 값과 달랐으며, 두 번째 주에 가장 두드러진 차이가 발생했음을 추가로 확인합니다. 표 1 및 표 2의 데이터는 그림 5 및 그림 7에 묘사된 이미징 결과를 확증합니다.

그림 1: 쥐의 아킬레스건 모델. (A) 아킬레스건 부상 모델; (B) 아킬레스건 파열 모델. (C) 쥐에서 아킬레스 건의 정상적인 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 라벨링 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 쥐의 아킬레스건을 스캐닝 필드의 중앙에 유지하기 위한 특수 고정 방법.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: [68 Ga]-NOTA-FAP-2286의 방사성 HPLC 및 자외선 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: PET 이미징 결과. (A) 주사 후 30분, (B) 주사 후 60분, (C) 주사 후 90분 시점의 아킬레스건 파열 모델 이미징. (D) 주사 후 30분, (E) 주사 후 60분, (F) 주사 후 90분에 아킬레스건 손상 모델을 이미징합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: CT 영상 촬영 결과. (A) 7일, (B) 14일, (C) 21일 후 파열된 아킬레스건에 대한 CT 영상. (D) 7일, (E) 14일, (F) 21일 후 손상된 아킬레스건에 대한 CT 영상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: PET-CT 영상의 MIP 결과. (A) 7일, (B) 14일, (C) 21일 후 파열된 아킬레스건에 대한 PET-CT 영상의 MIP. (D) 7일, (E) 14일, (F) 21일 후 손상된 아킬레스건에 대한 PET-CT 영상의 MIP. 약어: MIP = 최대 강도 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 주사 후 30분, 60분 및 90분 동안 다른 장기의 SUV 값. 약어: SUV = standardized uptake value.

표 2: 모델링 후 1주, 2주, 3주 동안 다른 장기의 SUV 값. 약어: SUV = standardized uptake value.

이미지는 오른쪽과 왼쪽의 현저한 차이를 보여줍니다. 작은 동물 PET 스캔은 정상 아킬레스건과 부상/파열된 아킬레스건의 차이를 명확하게 보여줍니다. 이러한 차이는 부상/파열 쪽에 FAP가 축적되어 이미징 에이전트의 흡수가 증가했기 때문일 수 있습니다. SUV_max 및 SUV_평균 측정과 함께 이미징 실험은 부상/파열된 아킬레스건과 정상 아킬레스건 사이의 대조를 명확하게 보여줍니다. 복구 과정 중 FAP 발현의 변화는 PET 이미징을 사용하여 효과적으로 모니터링할 수 있습니다.

이 프로토콜의 성공은 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 방사성 추적자의 준비 및 품질 관리가 가장 중요합니다. 여기에는 높은 방사성 화학 순도와 특정 활성을 보장하기 위해 정밀한 방사 화학 기술을 사용하는 것이 포함됩니다. 둘째, 쥐 모델에서 아킬레스건 부상을 정확하게 유도하는 것은 피험자 간에 일관성을 유지하는 데 중요합니다. 표준화된 수술 기법과 수술 후 관리는 확립된 프로토콜에 따라야 합니다. 셋째, 부상 후 PET/CT 영상의 최적 타이밍을 결정하는 것은 치유 과정의 가장 유익한 단계를 효과적으로 포착하는 데 필수적입니다. FAP 발현의 진행을 정확하게 추적하기 위해 일련의 시점이 필요할 수 있습니다. 넷째, 신호 대 잡음비와 공간 해상도를 모두 최대화하기 위해서는 세심한 이미지 획득 및 재구성 프로토콜이 필요한데, 이는 소동물 이미징 연구에서 특히 까다로울 수 있습니다⁹. 마지막으로, PET/CT 데이터의 엄격한 정량 분석은 힘줄 치유 과정에 대한 의미 있는 정보를 추출하는 데 중요한 역할을 합니다. 여기에는 SUV와 같은 측정 및 잠재적으로 텍스처 분석을 통합할 수 있는 측정이 포함됩니다. 또한, 방사성 추적자는 종양에서 빠른 흡수와 장기간 유지를 보여줍니다.

프로토콜을 최적화하기 위해 몇 가지 수정 및 문제 해결 전략을 고려할 수 있습니다. 방사성 추적자 선량 또는 이미징 시점의 조정은 최적의 신호 대 잡음비를 달성하고 최소한의 배경 신호와 충분한 흡수의 균형을 맞추기 위해 필요할 수 있습니다. 힘줄 부상 모델의 개선은 압착 부상이나 열상 정도에 가해지는 힘의 표준화를 통해 피험자 전반에 걸쳐 일관성을 보장하는 데 필수적입니다. 움직임 보정 기술의 구현은 호흡기 또는 기타 불수의적 움직임으로 인한 인공물을 최소화하기 위해 소동물 이미징에서 중요할 수 있습니다. 반복 재구성 방법을 포함한 대체 이미지 재구성 알고리즘을 탐색하면 공간 해상도와 정량적 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 또한 동적 PET 이미징을 통합하면 손상된 힘줄에서 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 흡수의 동역학에 대한 더 깊은 통찰력을 제공할 수 있으므로 치유 과정에 대한 보다 포괄적인 정보를 제공할 수 있습니다. NOTA-FAP-2286은 또한 다양한 질병, 특히 정형외과적 질환의 진단 및 치료에 상당한 잠재력을 입증했다¹⁰. 골육종 및 전이성 골종양과 같은 악성 및 양성 골종양에서 NOTA-FAP-2286은 FAP에 대한 높은 특이성을 제공하여 정밀한 PET/CT 영상 및 치료 응용을 가능하게 합니다¹¹. 또한, 관절 섬유증, 골절 치유 장애, 관절염과 같은 염증성 및 섬유성 질환에서 NOTA-FAP-2286은 병리학적 과정과 질병 활성에 대한 귀중한 통찰력을 제공한다¹².

혁신적이기는 하지만 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. PET 이미징의 공간 해상도는 일반적으로 소형 동물 스캐너의 경우 1mm에서 2mm 사이이며, 특히 초기 단계나 작은 병변의 경우 힘줄 치유의 미묘한 변화를 감지하는 능력을 제한할 수 있다¹⁰. 주변 조직에서 비특이적 방사성 추적자가 흡수될 수 있는 잠재적 위험이 있으며, 이는 특히 복잡한 해부학적 영역에서 결과 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 또한 방사선 화학 및 소동물 이미징에 대한 전문 장비와 전문 지식에 대한 요구 사항으로 인해 광범위한 채택이 제한될 수 있습니다. 쥐 모델의 연구 결과를 인간 응용 프로그램으로 변환하는 것은 힘줄 크기, 치유 과정 및 부상 규모의 변화로 인해 어려움을 겪습니다. 또한 PET 이미징과 관련된 방사선 노출은 최소화되지만 동일한 동물에 대한 종단 연구의 빈도를 제한할 수 있습니다.

FAP 표적 PET/CT 영상의 중요성은 힘줄 치유 과정에 대한 특이적이고 민감한 분자 수준 시각화를 제공할 수 있는 잠재력에 있습니다⁹. MRI 또는 초음파와 같은 기존 이미징 기술과 비교할 때 이 기술은 힘줄 치유의 중요한 과정인 섬유아세포 활성화에 대한 고유한 통찰력을 제공합니다. 이를 통해 시간 경과에 따른 치유 진행을 정량적으로 평가할 수 있으므로 잠재적으로 치유 과정에서 이상이나 합병증을 조기에 감지할 수 있습니다. 주로 포도당 대사를 반영하는 [¹⁸F]-FDG와 같은 다른 PET 추적자와 달리 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286은 FAP를 특이적으로 표적으로 하므로 힘줄 복구 중 섬유아세포 반응에 대한 보다 정확한 정보를 제공합니다. 이러한 특이성은 정상적인 치유와 병리학적 과정을 구별하는 능력을 향상시켜 보다 정확한 병변 특성화로 이어집니다.

힘줄 부상 연구에서 이 방법의 중요성은 다방면에 걸쳐 있습니다. 전임상 연구에서 힘줄의 치유 과정을 모니터링하기 위한 비침습적 접근 방식을 제공하여 반복적인 생검을 하거나 다양한 시점에서 동물을 희생할 필요 없이 종단 평가를 용이하게 합니다. 이를 통해 연구에 필요한 동물의 수를 크게 줄일 수 있을 뿐만 아니라 보다 일관된 데이터를 얻을 수 있습니다. 또한 이 방법은 치료 효과에 대한 정량적 측정을 제공함으로써 힘줄 손상에 대한 새로운 치료 개입을 평가할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다. 또한, 힘줄 복구 및 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 수 있으며, 잠재적으로 새로운 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 특히 흥미로운 것은 인간의 힘줄 부상에 대한 진단과 관리를 향상시킬 수 있기 때문에 임상 응용 분야로 전환될 수 있다는 것입니다. 정형외과 연구, 스포츠 의학 및 재생 의학 분야 모두에서 이 이미징 기술은 힘줄 치유와 관련된 전략을 이해하고 최적화하는 강력한 도구가 될 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 궁극적으로 환자 결과를 개선할 수 있습니다.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 Zhejiang Medical and Health Science and Technology Program(보조금 번호 2023KY694), Zhejiang Natural Science Foundation(보조금 번호: LTG23H180014)의 지원을 받았습니다.