ラットアキレス腱損傷モデルにおける腱損傷のイメージングのための[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286を用いたPET/CT

ここでは、[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 PET/CTイメージングを利用して、腱損傷の検出と正確な位置特定に高い感度を示すためのプロトコルを紹介します。

腱の損傷、特にアキレス腱に影響を与える損傷は、患者の生活の質に大きな影響を与える一般的なスポーツ関連の状態です。MRIや超音波などの既存の診断法は広く使用されていますが、正確な病理学的情報が得られない場合があります。この研究は、アキレス腱損傷の実験的ラットモデルを評価するために、[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286陽電子放出断層撮影/コンピューター断層撮影(PET/CT)イメージングの使用可能性を調査することを目的としていました。[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 PET/CTイメージングの適用は、腱損傷の検出と正確な位置特定において高い感度を示し、従来のイメージング技術と比較してより包括的な病理学的洞察を提供しました。活性化線維芽細胞のマーカーである線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)は、腱の修復プロセスにおいて重要な役割を果たします。トレーサーの取り込みは、モデリング後の最初の週から負傷/破裂した側から始まり、2週目にピークに達しました。これらの結果は、アキレス腱の損傷と断裂によって活性化されたFAP発現が、修復プロセスの2週目に最高レベルに達したことを示しています。[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286トレーサーの特異性を活用することにより、この新しいイメージングアプローチは、動物モデルにおける腱損傷の程度と進行を正確に視覚化します。

線維芽細胞は、ほぼすべての組織に遍在し、通常は静止状態で存在します。組織の完全性が破壊されると、線維芽細胞は活性化して損傷部位に移動し、修復プロセスを調整^します1。修復が完了すると、線維芽細胞は通常、静止状態に戻ります。ただし、慢性炎症または線維症の状態では、それらは持続的に活性化されたままである可能性があります。.FAPは、活性化された線維芽細胞の表面に発現する膜貫通タンパク質です。最近の研究では、乳がん、肺がん、結腸直腸がんなど、さまざまな重要な腫瘍実体を特定するためにFAPを追跡するための非常に有望な非侵襲的方法が実証^{されています2。}このアプローチは、腱損傷の診断におけるその可能性についてさらに調査することができます。

腱の損傷は、筋骨格系の重大な問題であり、一般医療における筋骨格系関連の診察全体の約30%を占めています³。これらの怪我は、さまざまな年齢層や人口統計で蔓延しており、30歳以上の個人、反復運動に従事する職業グループ、およびアスリートの間で特に発生率が高くなっています。注目すべき例としては、回旋筋腱板損傷、アキレス腱断裂、膝蓋腱障害、テニス肘などがあり、それぞれが異なる発生率と罹患集団を示しています4,5,6,7。B超音波やMRIなどの診断法は、腱損傷の評価に一般的に使用されます。しかし、創傷表面の周囲に線維芽細胞が蓄積する腱の特徴的な治癒過程を考慮して、Al[¹⁸F]-NOTA-FAPI-04 のイメージング腱損傷モデル⁸への使用を調査する研究が行われました。この知見は、FAPIを用いたPET-CTイメージングが、腱の治癒過程をモニタリングし、損傷の重症度を評価するための効果的な方法として役立つ可能性があるという仮説を支持している。

[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286は、腫瘍微小環境におけるFAPを特異的に標的とする利点を、より長い保持時間で実現します。現在、腫瘍の画像診断に使用されています。私たちの知る限り、[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 を使用した PET/CT は、腱損傷の画像診断に使用されていません。したがって、腱損傷のイメージングにおける [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 を使用した PET/CT の応用を探るために、この研究を実施しました。

すべての動物実験は、浙江大学医学部第一附属病院の動物実験倫理基準に従って行われました。(参照番号:20241008)。 ⁶⁸名Gaは、崩壊から陽電子を放出する放射性元素で、陽電子は周囲の電子と素早く結合してガンマ線を放出します。ガンマ線は皮膚を透過する可能性があり、体に放射線障害のリスクをもたらします。すべての実験要員は、関連する実験を行う前に、放射線の安全と防護の訓練を受けなければなりません。実験中は、放射線量計や遮蔽器具などの防護具を着用する必要があります。実験で発生した放射性廃棄物は、実験後に適切に処理する必要があります。

1. 動物モデルの準備とモデリングプロセス

1. 準備
   1. 雄のSprague-Dawley(SD)ラット(6-8週齢、~250g、n = 8)を入手します。標準的な実験室条件下で、食物と水に 7日間自由 にアクセスできる状態で順応させます。それらを使用して、アキレス腱の損傷と断裂のモデルを確立します。
   2. ラットをランダムに2つのグループに分けます:グループ1:アキレス腱損傷モデル(n = 4);グループ 2: アキレス腱損傷モデル (n = 4)。
2. モデリングプロセス
   1. 器具を準備します:メス、止血鉗子、標準鉗子、イソフルラン、酸素、アルコール綿棒、ヨードフォア、固定プレート、外科用縫合糸、針。
   2. イソフルラン-酸素混合物(1:1)を用いた誘導室でラットに麻酔をかけます。意識不明のラットを固定ボードに固定し、イソフルラン酸素を連続的に供給するガスマスクを使用して麻酔を維持します。
   3. 手術器具をアルコールで滅菌し、手術部位を消毒します。
   4. アキレス腱損傷モデルを確立します。
      1. 脱毛クリームを右後肢にまんべんなく塗り、5分ほど待ってからカミソリで脱毛します。
      2. メスを使用して縦方向に切開し、アキレス腱を露出させます。
      3. 止血鉗子を使用して腱が平らになるまで腱を圧迫します。
      4. 縫合糸で切開部を閉じます。
   5. アキレス腱断裂のモデルを確立する。
      1. 手順1.2.4.1と1.2.4.2に従って、Achilies腱を露出させます。
      2. 止血鉗子を使用してアキレス腱をつかみ、手術用ハサミを使用して全層正中線切開を作成します(図1)。
      3. 切断された腱を縫合し、皮膚切開部を閉じます。
   6. ラットに苦痛の兆候がないか監視し、適切な創傷治癒を確認します。術後1週間でPETイメージングを行います。

2. ⁶⁸ Ga-NOTA-FAP2286の合成

注: ⁶⁸Ga(半減期:68分)は ^、67Ge/⁶⁸Ga発生器から得られます。

1. 50 μgの前駆体を調製し、800 μLの無水アセトニトリルに溶解し、0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液3 mLを加えてpHを~4に調整します。 ⁶⁷Ge/⁶⁸Gaジェネレーター(5 mL/3分、シリンジ内に気泡がないことを確認してください)を溶出します。
2. シリカゲルヘッドシリンジを使用して0.1 M塩酸を5 mL引き出し、塩酸を⁶⁷Ge / ⁶⁸Gaジェネレーターに注入して⁶⁸Gaを溶出します。
   注意: 塩酸と金属の接触を避けてください。
3. 溶解した前駆体(NOTA-FAP-2286、CAS登録番号:2583823-71-4)と溶出した ^68Gaを混合し、35°Cのヒーターに20分間置きます(標識反応を 図2に示します)。
4. 製品を精製するには、10 mL のエタノールと 10 mL の水で C18 カラムを事前に活性化します。製品をC18カラムに置き、1 mLの50%エタノールですすいで最終製品を得ます。
5. エタノールを蒸発させます。最終製品のボトルを80°Cで~20分間加熱し、蒸発によって溶液から余分なエタノールを取り除きます。
6. HPLCを使用して品質管理チェックを実行します:移動相:A(0.1%H₃PO₄ 水溶液)、72%-52%、0-20分;B(CH₃CN)、28%-48%、0-20分;流量:3mL/分

3. 小動物PETイメージング

1. ラットを拘束具に固定します。500μciの68GA-NOTA-FAP2286を尾静脈を介して両群のラットに投与します。.
2. 誘導室でイソフルランを使用して麻酔を誘発します。
3. 完全に麻酔をかけたラットを、アキレス腱をスキャンフィールドの中心にしてスキャンフィールドに配置します(図3)。
4. 小動物のPETスキャンを行い、イメージング結果を取得します。
   1. 小動物用PETシステムに接続されているコンピュータの電源を入れます。 CT Acquisition をクリックして、CTシステムの予熱プロセスを開始します。
   2. 予熱が完了したら、 スキャンプロトコル を選択し、対応するスキャンワークフローを開きます( スキャン 時間は 10分にプリセットされています)。
   3. スカウトビューをクリックして、スキャンフィールドの中央にあるアキレス腱の位置を確認します。位置が正しい場合は、[ワークフローの開始]をクリックしてPETスキャンとCTスキャンを実行します。
      1. NCTベッドビュー:0-36.2-76.4 mm、CTスキャン時間:60 s/1ベッド。PET:時間で取得:600秒。511 KeVフォトピークエネルギーレベル;350 Kev低レベルの差別;650 KeVの上位レベルの識別。3.432nsのタイミング・ウィンドウ。
   4. スキャンが完了したら、[ 再構築 ]をクリックしてスキャンファイルを再構築し、イメージング結果を取得します。 Research Workplace を使用して、画像の後処理を行います。

[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286の収率70%以上(崩壊補正済み)の合成に成功し、95%を超える放射化学純度を達成しました。HPLCプロファイルを図4に示します。腱損傷モデルが外科的に確立され、[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286が静脈内投与され、続いて小動物PETイメージングが成功しました。結果を図 5、図 6、および図 7 に示します。PET画像(図5)に示すように、トレーサーの取り込みは注射後30分で損傷/破裂した側から始まり、次の90分にわたって増加し続け、正常なアキレス腱および筋肉組織と比較して有意な違いを示しています。対照的に、図6は、CT画像で負傷/断裂したアキレス腱と正常なアキレス腱を区別することが難しいことを示しています。図7の最大強度投影(MIP)画像は、モデリング後1週間目から負傷/骨折した側からトレーサーの取り込みが始まり、2週目にピークに達したことを示しており、アキレス腱の損傷と断裂によって活性化されるFAP発現が、修復プロセスの2週目に最高レベルに達することを示しています。特定のSUV値は、表1および表2に示されています。表 1 は、注入後 30 分、60 分、および 90 分で、骨折/損傷側の最大および平均 SUV 値が正常なアキレス腱および筋肉組織の値よりも有意に高く、3 つの時点すべてで統計的有意性が観察されたことを示しています。表 2 はさらに、最初の 3 週間で、骨折/損傷側の SUV 値が正常側および筋肉組織の SUV 値と異なり、最も顕著な違いは 2 週目に発生したことを確認しています。表1と表2のデータは、図5と図7に示されている画像所見を裏付けています。

図1:ラットのアキレス腱モデル(A)アキレス腱損傷モデル。(B)アキレス腱断裂モデル。(C)ラットのアキレス腱の正常な構造。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:標識反応 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3:ラットのアキレス腱をスキャンフィールドの中心に保つための特別な固定方法。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:[68 Ga]-NOTA-FAP-2286の放射性HPLCおよび紫外線スペクトル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:PETイメージングの結果。 (A)注射30分後、(B)注射60分後、(C)注射90分後のアキレス腱断裂モデルのイメージング。(D)注射30分後、(E)注射60分後、(F)注射90分後のアキレス腱損傷モデルのイメージング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:CT画像の結果。 (A)7日後、(B)14日後、(C)21日後のアキレス腱断裂のCT画像。(D)7日後、(E)14日後、(F)21日後の負傷したアキレス腱のCT画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:PET-CTイメージングのMIPの結果。 (A)7日後、(B)14日後、(C)21日後の断裂したアキレス腱のPET-CTイメージングのMIP。(D)7日後、(E)14日後、(F)21日後の損傷したアキレス腱のPET-CTイメージングのMIP。略語:MIP =最大強度投影。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:注射後30分、60分、90分の異なる臓器のSUV値。 略称:SUV=標準化された普及率。

表2:モデリング後1週間、2週間後、および3週間後のさまざまな臓器のSUV値。 略称:SUV=標準化された普及率。

画像は、右側と左側の間に顕著な違いを示しています。小動物のPETスキャンは、正常なアキレス腱と負傷/断裂したアキレス腱の違いを明確に示しています。これらの違いは、損傷/破裂した側にFAPが蓄積し、造影剤の摂取が増加することに起因する可能性があります。イメージング実験とSUV_max およびSUV_mean の測定により、負傷/断裂したアキレス腱と正常なアキレス腱とのコントラストが明確に示されています。修復過程におけるFAP発現の変化は、PETイメージングを用いて効果的にモニタリングすることができます。

このプロトコルの成功は、いくつかの重要なステップにかかっています。まず、[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286放射性トレーサーの調製と品質管理が最も重要です。これには、高い放射化学的純度と比活性を確保するために、正確な放射化学的技術を採用することが含まれます。次に、ラットモデルでアキレス腱損傷を正確に誘発することは、被験者間の一貫性を維持するために重要です。標準化された外科的技術と術後ケアは、確立されたプロトコルに従って行う必要があります。第三に、損傷後のPET/CTイメージングの最適なタイミングを決定することは、治癒プロセスの最も有益な段階を効果的に捉えるために不可欠です。FAP発現の進行を正確に追跡するために、一連の時点が必要になる場合があります。第四に、S/N比と空間分解能の両方を最大化するためには、綿密な画像取得と再構成のプロトコルが必要であり、これは小動物の^{イメージング研究9}で特に困難になる可能性があります。最後に、PET/CTデータの厳密な定量分析は、腱の治癒過程に関する有意義な情報を抽出する上で重要な役割を果たします。これには、SUVなどの測定や、テクスチャ分析を組み込む可能性のあるものが含まれます。さらに、放射性トレーサーは、腫瘍への急速な取り込みと長期の保持を示します。

プロトコルを最適化するために、いくつかの変更とトラブルシューティング戦略を検討できます。最適なS/N比を達成するためには、放射性トレーサーの線量やイメージングの時点の調整が必要となり、十分な取り込みと最小限のバックグラウンドシグナルのバランスをとることができます。腱損傷モデルの改良は、挫傷や裂傷の程度に加えられる力を標準化することにより、被験者間の一貫性を確保するために不可欠です。運動補正技術の実装は、呼吸器やその他の不随意運動によって引き起こされるアーチファクトを最小限に抑えるために、小動物のイメージングにおいて重要になる可能性があります。反復再構成法を含む代替の画像再構成アルゴリズムを探求することは、空間分解能と定量的精度の向上に有望です。さらに、動的PETイメージングを組み込むことで、損傷した腱における[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286の取り込みの動態についてより深い洞察を得ることができ、それによって治癒過程に関するより包括的な情報を提供することができる。NOTA-FAP-2286は、さまざまな疾患、特に整形外科的状態¹⁰の診断と治療において大きな可能性を示しています。骨肉腫や転移性骨腫瘍などの悪性および良性の骨腫瘍において、NOTA-FAP-2286はFAPに対して高い特異性を提供し、正確なPET/CTイメージングおよび治療アプリケーションを可能にします¹¹。さらに、関節線維症、骨折治癒障害、関節炎などの炎症性および線維性の状態において、NOTA-FAP-2286は病理学的プロセスおよび疾患活動性に関する貴重な洞察を提供する¹²。

この方法は革新的ですが、いくつかの制限があります。PETイメージングの空間分解能は、通常、小動物スキャナーでは1mmから2mmの範囲であり、特に初期段階または小さな病変¹⁰において、腱治癒の微妙な変化を検出する能力を制限する可能性がある。周辺組織における非特異的放射性トレーサーの取り込みの潜在的なリスクがあり、特に複雑な解剖学的領域では、結果の解釈を複雑にする可能性があります。さらに、放射化学や小動物イメージングに特化した機器や専門知識が必要なため、その普及が制限される可能性があります。ラットモデルから得られた知見をヒトへの応用につなげるには、腱のサイズ、治癒過程、損傷の規模などが異なるため、課題があります。さらに、PETイメージングに関連する放射線被ばくは最小限ですが、同じ動物に対する縦断的研究の頻度を制限する可能性があります。

FAP標的PET / CTイメージングの重要性は、腱の治癒過程の特異的で高感度な分子レベルの視覚化を提供する可能性にあります⁹。MRIや超音波などの従来の画像技術と比較して、この技術は、腱の治癒における重要なプロセスである線維芽細胞の活性化に関する独自の洞察を提供します。これにより、経時的な治癒の進行を定量的に評価することができ、治癒過程における異常や合併症の早期発見が可能になる可能性があります。[¹⁸F]-FDGのような他のPETトレーサーとは異なり、主にグルコース代謝を反映する[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286はFAPを特異的に標的とするため、腱修復中の線維芽細胞反応に関するより正確な情報を提供します。この特異性により、正常な治癒過程と病理学的過程を区別する能力が向上し、より正確な病変の特性評価につながります。

腱損傷研究におけるこの方法の重要性は多面的です。これは、前臨床試験で腱の治癒過程を監視するための非侵襲的アプローチを提供し、生検を繰り返したり、さまざまな時点で動物を犠牲にしたりすることなく、縦断的評価を容易にします。これにより、研究に必要な動物の数が大幅に減少するだけでなく、より一貫性のあるデータが得られます。さらに、この方法は、治療効果の定量的測定を提供することにより、腱損傷に対する新しい治療介入を評価することが期待されています。さらに、腱の修復と再生の根底にある分子メカニズムの調査にも役立ち、新しい治療標的を特定できる可能性があります。特に興味深いのは、ヒトの腱損傷の診断と管理を強化する可能性があるため、臨床応用への応用の可能性です。整形外科研究、スポーツ医学、再生医療の分野でも、このイメージング技術は、腱の治癒に関連する戦略を理解し最適化するための強力なツールとなり、最終的には患者の転帰の改善につながる可能性を秘めています。

著者には、開示すべき利益相反はありません。

本研究は、浙江省自然科学基金会(助成金番号:LTG23H180014)の浙江医療保健科学技術プログラム(助成金No.2023KY694)の助成を受けました。