U-образная техника горизонтального плавания для получения высококачественной спермы с низким индексом фрагментации ДНК

Этот протокол описывает метод скрининга высококачественной спермы с низким индексом фрагментации ДНК с использованием характеристик подвижности сперматозоидов и тигмотаксиса. В методе используется U-образная горизонтальная плавательная дорожка, позволяющая высококачественной сперме достигать противоположной стороны через буферные капли, в то время как мертвые сперматозоиды, клеточный мусор и примеси исключаются.

Сперма человека представляет собой сложную смесь, состоящую из прогрессивно подвижных сперматозоидов, непрогрессивно подвижных сперматозоидов, неподвижных сперматозоидов, клеточных остатков и вязкой семенной плазмы. Высококачественные сперматозоиды относятся к прогрессивно подвижным сперматозоидам с нормальной морфологией, которые часто демонстрируют более низкий индекс фрагментации ДНК (DFI) и более высокий потенциал оплодотворения. Подготовка высококачественной спермы является важнейшим этапом в области вспомогательных репродуктивных технологий человека. Традиционный метод подготовки спермы, прерывистое центрифугирование с градиентом плотности (DGC), является трудоемким и трудоемким. Повторное центрифугирование может повредить ДНК сперматозоидов, тем самым повлияв на последующее оплодотворение и развитие эмбриона. В данном исследовании представлен метод U-образного горизонтального плавания (UHS) для подготовки сперматозоидов для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ), который значительно устраняет вредное воздействие центрифугирования на ДНК сперматозоидов. Метод UHS включает в себя создание полосы UHS с использованием среды для внесения удобрений в рабочей чашке ICSI. Микрокапля среды для удобрения объемом 10 мкл помещается в начальную точку с левой стороны полосы UHS для удержания спермы. Две дополнительные капли буферной среды объемом 10 мкл располагаются через определенные промежутки времени вдоль левого среднего участка дорожки, причем все капли соединены средой для внесения удобрений. Затем чашку заливают культуральным маслом и инкубируют в течение ночи при 37 °C с 6%_CO2 для балансировки. Затем в микрокаплю в начальной точке добавляют 3 мкл спермы. Высококачественные сперматозоиды подплывают к правой стороне полосы UHS, облегчая их всасывание в иглу для инъекции ИКСИ. Мертвые сперматозоиды, клеточный мусор и другие вязкие примеси в основном остаются в исходной точке или в буферных каплях. Мы одновременно обработали 21 образец спермы с использованием методов UHS и DGC и сравнили их DFI. Результаты показали, что DFI в группе DGC составил 5,5% ± 3,2%, в то время как DFI в группе UHS составил 1,7% ± 1,1%. Разница между двумя группами была статистически значимой (P < 0,05).

Методы оптимизации спермы и подготовки сперматозоидов играют решающую роль в получении клеточных фракций, обогащенных структурно и функционально превосходящими сперматозоидами, что является ключевым этапом в технологиях вспомогательной репродукции человека¹. Целью оптимизации спермы является: (1) уменьшение или удаление простагландинов, иммуноактивных клеток, антиспермальных антител, неподвижных низкокачественных сперматозоидов, бактерий и мусора в семенной плазме; (2) Уменьшить или устранить вязкость спермы; и (3) Способствуют емкости сперматозоидов и повышают способность к оплодотворению. Идеальный метод получения спермы должен восстанавливать высокофункциональную популяцию сперматозоидов, которая сохраняет целостность ДНК и не вызывает дисфункцию за счет производства активных форм кислорода (АФК) сперматозоидами и лейкоцитами2^.

Наиболее широко используемой технологией получения спермы в настоящее время является метод DGC. Преимуществами этого метода являются его высокая скорость^{восстановления3} и легкая стандартизация. При практическом использовании его можно гибко выбирать в зависимости от качества образца для метода двойного градиента⁴, метода mini-DGC или метода центрифугирования с однослойным градиентом⁵. Этот метод может быть использован для получения высококачественной спермы с хорошей жизнеспособностью, свободной от клеточных остатков, загрязненных лейкоцитов, незародышевых клеток и вырожденных зародышевых клеток. Однако недостатком этого метода является то, что он требует центрифугирования, что может привести к повреждению ДНК⁶ сперматозоидов.

Представленный здесь метод был адаптирован из оригинального исследования Baldini et ^al.7, в котором основное внимание уделялось горизонтальной миграции сперматозоидов в инъекционных чашках. Этот модифицированный метод включает в себя U-образную горизонтальную полосу для отделения высококачественных сперматозоидов с высокой жизнеспособностью. Он позволяет избежать повреждения ДНК, вызванного центрифугированием, и сводит к минимуму влияние мертвых сперматозоидов, остатков клеток и других вязких примесей во время процедур интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ).

Специфический подход включает в себя использование удобряющей среды для создания полосы UHS в операционной чашке ИКСИ. Микрокапля среды для удобрения объемом 10 мкл помещается в левую начальную точку полосы UHS для удержания спермы. Две дополнительные капли буферной среды по 10 мкл удобрения располагаются с интервалом в левом среднем участке полосы UHS, и все капли соединяются средой для внесения удобрений. После покрытия установки маслом для выращивания чашка инкубируется в течение ночи при температуре 37 °C с 6%_CO2 для уравновешивания. Затем в микрокаплю добавляют 3 мкл спермы в начальной точке с левой стороны полосы UHS. Высококачественные сперматозоиды подплывают к дорожке с правой стороны полосы UHS, облегчая их сбор с помощью иглы для инъекции ИКСИ. Мертвые сперматозоиды, клеточный мусор и другие вязкие примеси в основном остаются на исходном месте или в буферных каплях.

Микрофлюидный чип имитирует процесс естественного отбора в женском репродуктивном тракте, что позволяет оптимально выделить высококачественную сперму из спермы без центрифугирования. Это имеет решающее значение для улучшения подвижности сперматозоидов⁸, снижения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов⁹ и улучшения исходов беременности¹⁰. Тем не менее, изготовление таких устройств является сложным, дорогостоящим и трудным для широкого внедрения.

Описанный здесь протокол предлагает новую, простую и осуществимую альтернативу. Используя характеристики подвижности сперматозоидов, этот метод позволяет достичь результатов, сравнимых с микрофлюидными технологиями. Подготовленные сперматозоиды обладают высокой жизнеспособностью, низкими показателями фрагментации ДНК и хорошо подходят для использования в ИКСИ.

Это исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Первой народной больницы Хуайаня Медицинского университета Нанкина (номер одобрения: KY-2024-181-01). Информированное согласие было получено от пациентов, образцы которых использовались в данном исследовании. Процедура должна проводиться опытным персоналом в соответствии с надлежащей лабораторной практикой и клиническими рекомендациями^11,12. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов.

1. Приготовление операционной тарелки ИКСИ

1. Используйте среду для удобрения объемом 20 мкл для создания U-образных дорожек в операционной чашке ИКСИ (рис. 1). Длина левой гусеницы-образной гусеницы должна составлять около 30 мм, а длина правой гусеницы также должна быть около 30 мм.
2. Всасывайте пипеткой 10 мкл удобряющей среды и создавайте круглую каплю в левой начальной точке U-образной дорожки. Соедините его с левой начальной точкой U-образной дорожки, чтобы добавить раствор спермы.
3. Создайте две капли буферной среды по 10 мкл с интервалом в левом среднем участке полосы UHS. Соедините все капли со средой для удобрения.
4. Создайте длинную полосу капли жидкости с правой стороны U-образной полосы с помощью 2,5 μL поливинилпирролидона (PVP). Убедитесь, что полоса PVP параллельна правой полосе U-образной полосы.
5. Сделайте шесть микрокапель, используя среду для обработки ооцитов с правой стороны полоски PVP, по 20 μл на каплю.
6. Добавьте в блюдо 7 мл питательного масла, следя за тем, чтобы масло покрывало самую высокую точку капли. Поместите его в инкубатор с температурой 37 °C, 6%_CO2 на ночь для баланса.

2. Сбор образцов спермы

1. Предоставьте пациентам четкие письменные и устные инструкции по сбору образца спермы. Убедитесь, что сбор образцов завершен, и проинструктируйте пациентов воздержаться от эякуляции в течение 3-7 дней до сбора.
2. Соберите сперму с помощью мастурбации в одноразовую, стерильную и нетоксичную специализированную чашку для сбора спермы. Убедитесь, что весь эякулят собран, и проинструктируйте пациента сообщать о любой потере любой части образца.
3. Проверьте имена, действительные документы, удостоверяющие личность, и отпечатки пальцев супруга/супруги пациента. Отметьте имя и номер медицинской карты супруга/супруги пациента на корпусе и крышке чаши для сбора спермы.
4. После того, как пациент мужского пола соберет сперму, передайте образец лицом к лицу между персоналом и пациентом. Возьмите небольшое количество образца спермы для упаковки и хранения. Убедитесь, что пациент делает знаки в зоне упаковки.
5. Пронумеруйте и храните инкапсулированные образцы в течение 2 лет. Записывайте информацию о пациенте, идентификационный номер и подписи реципиента и свидетелей в журнал обработки спермы.
6. Если кто-либо из сотрудников репродуктивного центра обнаружит подозрительную личность пациента, прекратите получение образца и повторно подтвердите личность пациента. Не принимайте два или более экземпляра одновременно. Если есть подозрение на путаницу у экземпляров, прекратите их получение.

3. Анализ спермы

1. Наблюдайте за цветом образцов спермы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная сперма после разжижения выглядит однородной и серовато-белой. Сперма с очень низкой концентрацией сперматозоидов может казаться прозрачной. Если присутствуют эритроциты, сперма может казаться красновато-коричневой. Если пациент страдает желтухой или принимает определенные витамины, сперма может иметь желтый цвет.
2. Измерьте объем спермы с помощью метода взвешивания, с точностью до 0,1 мл.
3. Поместите образец спермы при температуре 37 °C на 15-30 минут. Отасуньте его в пластиковую одноразовую пипетку с широким отверстием (примерно 1,5 мм в диаметре), позволив сперме капать под действием силы тяжести. Следите за длиной любой нити.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальный разжиженный эякулят образует маленькие, дискретные капли. Если вязкость будет аномальной, капля образует нить длиннее 2 см.
4. Если сперма все еще не разжижается в течение 60 минут, добавьте равное количество оплодотворяющей среды. Затем многократно вдохните и выдохните смесь с помощью одноразовой пластиковой пипетки для переноса до полного разжижения.
5. Измерьте значение pH спермы с помощью прецизионной бумаги для определения pH (pH 6,0-10,0).
6. Возьмите 10 μл полностью сжиженной спермы и капните ее в счетную камеру Маклера. Оцените подвижность сперматозоидов в 200-кратном поле с помощью оптического микроскопа. Наблюдайте за наличием агглютинации сперматозоидов и несперматозоидов.
7. Оцените концентрацию сперматозоидов в поле 200x с помощью оптического микроскопа.

4. Забор ооцитов

1. Приготовьте чашку для забора ооцитов (ОПД) за день до забора ооцитов. Добавьте 2,5 мл среды для обработки ооцитов в стерильную чашку для культуры диаметром 35 мм. Затем добавьте 1,5 мл масла и поместите чашку в инкубатор с температурой 37 °C на ночь для уравновешивания.
2. Приготовьте две чашки для посева ооцитов (ОКР) за день до забора ооцитов. Добавьте 1 мл среды для удобрения во внутреннее кольцо стерильной чашки для культуры в центральной лунке, затем добавьте 1 мл масла. Добавьте в наружное кольцо 4 мл среды для внесения удобрений. Поместите чашку в инкубатор с температурой 37 °C, 6%_CO2 для балансировки на ночь.
3. Включите все нагреватели и нагревательные пластины и измерьте температуру за 30 минут до забора ооцитов.
4. Вымойте руки дезинфицирующим средством для рук и тщательно промойте проточной водой. Надевайте чистые, стерильные и защищенные от пыли перчатки.
5. Разогрейте стерильную чашку для культуры на нагревательной платформе при температуре 37 °C.
6. Строго проверьте личность пациента перед забором ооцитов.
7. Вдохните фолликулярную жидкость в стерильные пробирки через отрицательное давление, после чего сразу же передайте ее лабораторным эмбриологам.
8. Перелейте всю фолликулярную жидкость в стерильные чашки для посева и ищите ооцитарные коронно-кучевые комплексы (OCCC) под стереомикроскопом с малым увеличением. Возьмите OCCC с помощью пипетки и поместите их в OPD для временного хранения при температуре 37 °C.
9. Запишите количество, цвет, количество фолликулов и количество OCCC в фолликулярной жидкости.
10. После забора ооцитов перенесите OCCCs в ОКР с помощью стерильной пипетки Пастера. Быстро поместите их в инкубатор для культур (37 °C, 6%_CO2, 5%_O2 и насыщенная влажность) на 2 часа.
11. Приготовьте четырехлуночное блюдо, добавьте в первую лунку по 0,5 мл раствора гиалуронидазы, а в каждую из остальных трех лунок по 1 мл среды для обработки ооцитов. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
12. С помощью пастеровской пипетки перенесите OCCC с шага 4.10 в хорошо содержащую гиалуронидазу в течение 30 с. Затем перенесите OCCC в хорошо содержащую среду для обработки ооцитов.
13. Используйте трубку для удаления ооцитов диаметром 150 мкм для продувки и аспирации OCCC для удаления гранулезных клеток. Затем с помощью новой пастеровской пипетки перенесите ооциты в среду для обработки ооцитов для промывания. Переведите их в другой предварительно уравновешенный ОКР и поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 6%_CO2 .

5. Отбор сперматозоидов и операция ИКСИ

1. Добавьте 5 мкл спермы в микрокаплю среды для оплодотворения в левой начальной точке U-образной дорожки в операционной чашке ИКСИ, которая была приготовлена с шага 1.1 по шаг 1.6.
2. Поместите операционную чашку ИКСИ в инкубатор при температуре 37 °C, 6%_CO2 на 30-60 минут.
3. Откройте инвертированный микроскоп, операционную систему микроскопа и нагревательный столик предметного стекла, чтобы убедиться, что все органы управления восстановлены до исходного контролируемого диапазона, что обеспечивает плавную и удобную работу.
4. Установите иглу ИКСИ в иглодержатель. Закрепите иглодержатель на микроманипуляторе, отрегулируйте удерживающую иглу и иглу для инъекции в объективе с 4-кратным увеличением и последовательно отрегулируйте их углы и положения так, чтобы две иглы были относительно и параллельны предметному столику. Проверьте диапазон перемещения операционной иглы под объективом × 20.
5. Отрегулируйте угол и положение иглы, удерживающей ооцит, и иглы для инъекций под объективом с 4-кратным увеличением так, чтобы две головки игл были относительно и параллельны предметному столику. Перемещайте операционную иглу вперед, назад, влево и вправо. Проверьте диапазон перемещения рабочей иглы под объективами 10x и 20x.
6. Поднимите иглу для удержания ооцитов и иглу для инъекций, чтобы расстояние между операционным столом и нагревательным столом позволяло легко разместить операционный сосуд, не касаясь операционной иглы.
7. После двойной проверки перенесите выбранные ооциты из шага 4.12 в микрокапли среды обработки ооцитов в операционной чашке ИКСИ, по одной на каплю.
8. Поместите операционную чашку, содержащую ооцит, на горячую сцену подготовленного оператора микроскопа.
9. Отрегулируйте фокусное расстояние микроскопа под объективом с 10-кратным увеличением, чтобы края микрокапель внутри операционной чашки были четкими и видимыми.
10. Опустите иглу для инъекций в полоску PVP операционной чашки для ИКСИ. Отрегулируйте микроскоп так, чтобы игла для инъекции была хорошо видна, и одновременно вдохните небольшое количество PVP в иглу для инъекций.
11. Переместите инъекционную иглу в длинную полоску с правой стороны U-образной дорожки и извлеките высококачественные сперматозоиды с хорошей морфологией и прогрессирующей подвижностью.
12. Перенесите сперму в полоску PVP с правой стороны и поместите сперму на дно операционной чашки.
13. Осторожно надавите на инъекционную иглу в средней или нижней части хвоста сперматозоида, быстро оттяните иглу назад и поцарапайте сперму, чтобы она остановилась.
14. Вдохните сперму от хвоста до головки в иглу для инъекций.
15. Перенесите иглу для инъекций в каплю среды для обработки ооцитов, содержащую ооцит с правой стороны.
16. Опустите иглу, удерживающую ооцит, и осторожно переместите ооцит так, чтобы оно располагалось первым полярным телом в положении «12 часов», фиксируя яйцеклетку.
17. Отрегулируйте микрохирургическую иглу и мембрану ооцита в одной горизонтальной плоскости. Подтолкните сперму к кончику инъекционной иглы.
18. Вертикально проведите через zona pellucida в 3 часа на ооците и продолжайте вводить иглу до тех пор, пока она не достигнет центра ооцита или немного не пересечет центральное положение, с небольшим втягиванием инъекционной иглы.
    Примечание: Когда в цитоплазме и сперматозоидах происходит быстрый рефлюкс, это указывает на то, что мембрана ооцита разорвана и аспирация остановлена.
19. Медленно введите сперматозоиды в цитоплазму ооцита и выйдите из инъекционной иглы. Глубина введения сперматозоида в цитоплазму должна составлять около 50%-75% от диаметра ооцита.
20. После извлечения инъекционной иглы отрегулируйте отрицательное давление иглы, удерживающей ооциты, чтобы выпустить ооциты.
21. Повторяйте описанные выше действия до тех пор, пока не будут введены все зрелые ооциты.
22. Перенесите чашку для ИКСИ с горячей плиты микроскопа на препарирующий микроскоп.
23. Достаньте чашу для расщепления культуры из инкубатора.
24. Перенесите введенную сперматозоидную яйцеклетку в микрокаплю в чашке для культуры расщепления.
25. Поместите чашку для расщепления обратно в инкубатор с температурой 37 °C, 6%_CO2, 5%_O2 .

6. Подготовка сперматозоидов методом ДГК

1. Добавьте 1,5 мл раствора для центрифугирования с градиентом плотности 45% в стерильную коническую пробирку с коническим дном объемом 15 мл.
2. Медленно добавьте 1,5 мл раствора для центрифугирования с градиентом плотности 90% на дно раствора для центрифугирования с градиентом плотности 45%, сохраняя границу раздела между двумя жидкостями.
3. Аккуратно добавьте сжиженную сперму в градиентный раствор для центрифугирования и центрифугируйте при 300 x g в течение 15 минут (при комнатной температуре).
4. Удалите надосадочную жидкость и добавьте примерно 0,5 мл оставшегося осадка спермы в 3 мл среды для удобрения. Подуть и хорошо перемешать.
5. Центрифуга при комнатной температуре 200 х г в течение 5 минут.
6. Пипеткой нанесите надосадочную жидкость и оставьте около 0,2 мл осадка.
7. Добавьте соответствующее количество удобряющей среды для ресуспендирования осадка, подсчитайте концентрацию и жизнеспособность сперматозоидов и запишите. Поместите в инкубатор с температурой 37°C, 6% CO2 для последующего использования.

7. Определение целостности ядерной ДНК сперматозоидов (метод дисперсии хроматина сперматозоидов, SCD)

1. Перед проведением эксперимента отрегулируйте температуру в помещении до 20-28 °C. Снимите набор реагентов и дайте ему уравновеситься при комнатной температуре в течение 30-60 минут.
2. Приготовьте денатурирующий раствор: Возьмите 0,8 мл концентрированного денатурирующего раствора и добавьте его в 100 мл дистиллированной воды.
3. Приготовьте 70% раствор этанола: Возьмите 26,65 мл дистиллированной воды и 70,35 мл безводного этанола для приготовления 70% раствора этанола.
4. Приготовьте 90% раствор этанола: Возьмите 9,55 мл дистиллированной воды и 90,45 мл безводного этанола для приготовления 90% раствора этанола.
5. Поместите агарозную трубку с низкой температурой плавления (содержащую 25 μл раствора агарозы с низкой температурой плавления) в водяную баню при температуре 90-100 °C на 1-2 минуты до полного расплавления агарозного геля. Затем поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C на 5 минут, пока температура не станет постоянной.
6. Принимайте 3-10 μл спермы перед оптимизационным лечением и суспензию сперматозоидов после оптимизационного лечения. Добавьте их в разные агарозные трубки с низкой температурой плавления, затем тщательно перемешайте.
7. Возьмите 30 μл агарозной суспензии с низкой температурой плавления, содержащей сперматозоиды, и опустите ее на предварительно обработанное предметное стекло в горизонтальном положении.
8. Аккуратно накройте покровное стекло (размером 22 мм х 11 мм) предметным стеклом, максимально избегая образования пузырьков.
9. Поместите предварительно обработанное стекло в холодильник при температуре 2-8 °C на 4 минуты, удерживая предметное стекло в горизонтальном положении на протяжении всего процесса. Достаньте предметное стекло из холодильника и аккуратно сдвиньте, чтобы снять покровное стекло.
10. Быстро погрузите предварительно обработанное предметное стекло в денатурирующий раствор на 7 мин.
11. Снимите предварительно обработанное предметное стекло и замочите его в дистиллированной воде на 5 с.
12. Снимите предварительно обработанное стекло и поставьте его в вертикальное положение. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы впитать любые капли воды на поверхности предметного стекла, и избегайте прикосновения к области образца.
13. Погрузите предварительно обработанное предметное стекло в буфер для лизиса и точно реагируйте в течение 20 минут.
14. Погрузите предварительно обработанные фрагменты в моющий раствор на 3 минуты, чтобы смыть лизисный раствор.
15. Снимите предварительно обработанное предметное стекло и погрузите его в 70% раствор этанола на 2 минуты.
16. Снимите предварительно обработанное предметное стекло и погрузите его в 90% раствор этанола на 2 мин.
17. Снимите предварительно обработанное предметное стекло и погрузите его в безводный раствор этанола на 2 мин.
18. Снимите предварительно обработанное стекло и дайте ему высохнуть на воздухе естественным образом.
19. Приготовьте раствор для морилки Райта А и раствор Б в коричневой пустой бутылке в соотношении 1:1.
20. Поместите предварительно обработанное предметное стекло горизонтально и добавьте смешанный раствор красителя на предметное стекло, следя за тем, чтобы раствор красителя покрывал все предметное стекло (около 0,5-1 мл раствора красителя).
21. После окрашивания в течение 5 минут аккуратно промойте предметное стекло дистиллированной водой 10-15 раз, чтобы удалить излишки красителя.
22. Дайте предметному стеклу высохнуть естественным образом и наблюдайте за ним под оптическим микроскопом при температуре 400×. Подсчитайте более 200 сперматозоидов и определите процент аномальных сперматозоидов с маленькими кольцами ореола, без гало-колец и дегенерацией.

8. Статистический анализ

1. Выполняйте статистический анализ с помощью коммерчески доступного программного обеспечения.
2. Сравните DFI (%) между исходной спермой, DGC и UHS с помощью теста Фридмана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для попарного сравнения двух методов используйте тест Вилкоксона со знаком. Рассмотрим p-значение ≤ 0,05 как статистически значимое.

Методы UHS и DGC были использованы для оптимизации обработки 21 образца и сравнения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов между двумя методами. Метод с использованием дорожки UHS в чашке ИКСИ может заменить DGC, что может привести к повреждению сперматозоидов. Высококаче...

Ключевым этапом отделения высококачественных сперматозоидов с помощью метода UHS, описанного в этой статье, является создание полосы UHS с буферными каплями. Как полоса UHS, так и буферные капли создаются с помощью промытой и полученной спермы. Дорожка UHS направляет высок...

Авторам нечего раскрывать.

Никакой.