Técnica de natação horizontal em forma de U para preparar espermatozóides de alta qualidade com baixo índice de fragmentação de DNA

Este protocolo descreve um método para triagem de espermatozoides de alta qualidade com baixo índice de fragmentação de DNA, utilizando características de motilidade espermática e tigmotaxia. O método emprega uma raia de natação horizontal em forma de U, permitindo que espermatozoides de alta qualidade alcancem o lado oposto por meio de gotículas tampão, enquanto espermatozoides mortos, detritos celulares e impurezas são excluídos.

O sêmen humano é uma mistura complexa que compreende espermatozóides progressivamente móveis, espermatozóides não progressivamente móveis, espermatozóides imóveis, detritos celulares e plasma seminal viscoso. Espermatozoides de alta qualidade referem-se a espermatozóides progressivamente móveis com morfologia normal, que geralmente exibem um índice de fragmentação de DNA (DFI) mais baixo e maior potencial de fertilização. A preparação de espermatozoides de alta qualidade é uma etapa crítica na tecnologia de reprodução assistida por humanos. O método tradicional de preparação de espermatozoides, centrifugação de gradiente de densidade descontínuo (DGC), é demorado e trabalhoso. A centrifugação repetida pode danificar o DNA do esperma, afetando assim a fertilização subsequente e o desenvolvimento embrionário. Este estudo apresenta um método de natação horizontal em forma de U (UHS) para preparar espermatozóides de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI), que elimina significativamente os efeitos prejudiciais da centrifugação no DNA do esperma. O método UHS envolve a criação de uma faixa UHS usando um meio de fertilização dentro de uma antena de operação ICSI. Uma microgotícula de meio de fertilização de 10 μL é colocada no ponto inicial no lado esquerdo da pista UHS para reter o sêmen. Duas gotículas adicionais de 10 μL de tampão de meio de fertilização são posicionadas em intervalos ao longo da seção central esquerda da pista, com todas as gotículas conectadas por meio de fertilização. O prato é então coberto com óleo de cultura e incubado durante a noite a 37 °C com 6% de CO₂ para equilibrar. Posteriormente, 3 μL de sêmen são adicionados à microgota no ponto de partida. Os espermatozóides de alta qualidade nadam para o lado direito da faixa UHS, facilitando sua sucção na agulha de injeção de ICSI. Espermatozóides mortos, detritos celulares e outras impurezas viscosas permanecem em grande parte no ponto inicial ou nas gotículas tampão. Processamos simultaneamente 21 amostras de sêmen usando as técnicas UHS e DGC e comparamos seus DFI. Os resultados demonstraram que o IFD no grupo DGC foi de 5,5% ± 3,2%, enquanto o DFI no grupo UHS foi de 1,7% ± 1,1%. A diferença entre os dois grupos foi estatisticamente significativa (P < 0,05).

As técnicas de otimização de sêmen e preparação de espermatozóides desempenham um papel crucial na obtenção de frações celulares enriquecidas com espermatozóides estrutural e funcionalmente superiores, que é uma etapa fundamental na tecnologia de reprodução assistida por humanos¹. O objetivo da otimização do sêmen é: (1) Reduzir ou remover prostaglandinas, células imunoativas, anticorpos anti-espermatozóides, espermatozóides imóveis de baixa qualidade, bactérias e detritos no plasma seminal; (2) Reduzir ou eliminar a viscosidade do sêmen; e (3) Promover a capacitação do esperma e aumentar a capacidade de fertilização. Uma técnica ideal de preparação de espermatozoides deve recuperar uma população de espermatozóides altamente funcional que preserve a integridade do DNA e não induza disfunção por meio da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por espermatozoides e leucócitos².

A tecnologia de preparação de espermatozóides mais utilizada atualmente é o método DGC. As vantagens desse método são sua alta taxa de recuperação³ e fácil padronização. No uso prático, ele pode ser selecionado de forma flexível com base na qualidade da amostra para o método de gradiente de dupla densidade⁴, método mini-DGC ou método de centrifugação de gradiente de camada única⁵. Este método pode ser usado para preparar espermatozóides de alta qualidade com boa vitalidade, livres de detritos celulares, glóbulos brancos contaminados, células não germinativas e células germinativas degeneradas. No entanto, a desvantagem desse método é que ele requer centrifugação, o que pode causar danos ao DNA do esperma⁶.

O método aqui apresentado foi adaptado do estudo original de Baldini et ^al.7, que se concentrou na migração horizontal de espermatozoides em placas de injeção. Este método modificado incorpora uma faixa horizontal em forma de U para separar espermatozoides de alta qualidade com forte vitalidade. Evita danos ao DNA causados pela centrifugação e minimiza a influência de espermatozoides mortos, detritos celulares e outras impurezas viscosas durante os procedimentos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).

A abordagem específica envolve o uso de um meio de fertilização para criar uma faixa UHS na antena de operação ICSI. Uma microgotícula de meio de fertilização de 10 μL é colocada no ponto inicial esquerdo da pista UHS para reter o sêmen. Duas gotículas adicionais de tampão de meio de fertilização de 10 μL são posicionadas em intervalos na seção central esquerda da faixa UHS, e todas as gotículas são conectadas por meio de fertilização. Depois de cobrir a instalação com óleo de cultivo, o prato é incubado durante a noite a 37 °C com 6% de CO₂ para equilíbrio. Posteriormente, 3 μL de sêmen são adicionados à microgota no ponto inicial no lado esquerdo da pista UHS. Espermatozoides de alta qualidade nadam até a pista do lado direito da pista UHS, facilitando sua coleta com a agulha de injeção de ICSI. Espermatozóides mortos, detritos celulares e outras impurezas viscosas permanecem principalmente no local original ou nas gotículas tampão.

O chip microfluídico simula o processo de seleção natural no trato reprodutivo feminino, permitindo o isolamento ideal de espermatozoides de alta qualidade do sêmen sem centrifugação. Isso é fundamental para melhorar a motilidade do esperma⁸, reduzir o índice de fragmentação do DNA do esperma⁹ e melhorar os resultados da gravidez¹⁰. No entanto, a fabricação de tais dispositivos é complexa, cara e difícil de implementar amplamente.

O protocolo aqui descrito oferece uma alternativa nova, simples e viável. Ao alavancar as características de motilidade espermática, este método alcança resultados comparáveis aos da tecnologia microfluídica. Os espermatozoides preparados exibem forte vitalidade, baixos índices de fragmentação do DNA e são adequados para uso em ICSI.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Primeiro Hospital Popular Afiliado de Huai'an da Universidade Médica de Nanjing (número de aprovação: KY-2024-181-01). O consentimento informado foi obtido dos pacientes cujas amostras foram utilizadas neste estudo. O procedimento deve ser conduzido por pessoal experiente, de acordo com as boas práticas laboratoriais e diretrizes clínicas^11,12. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação de uma antena parabólica de operação ICSI

1. Use meio de fertilização de 20 μL para criar faixas em forma de U na placa de operação ICSI (Figura 1). O comprimento da pista esquerda da pista em forma de U deve ser de cerca de 30 mm, e o comprimento da pista direita também deve ser de cerca de 30 mm.
2. Sugue 10 μL de meio de fertilização com uma pipeta e crie uma gota circular no ponto inicial esquerdo da pista em forma de U. Conecte-o com o ponto inicial esquerdo do trilho em forma de U para adicionar a solução estoque de sêmen.
3. Crie duas gotículas tampão de meio de fertilização de 10 μL em intervalos na seção intermediária esquerda da faixa UHS. Conecte todas as gotículas com o meio de fertilização.
4. Crie uma longa faixa de gotícula de líquido no lado direito da pista em forma de U usando 2,5 μL de polivinilpirrolidona (PVP). Certifique-se de que a faixa PVP esteja paralela à faixa direita da faixa em forma de U.
5. Faça seis microgotículas usando o meio de processamento de oócitos no lado direito da tira de PVP, com 20 μL por gota.
6. Adicione 7 mL de óleo de cultura ao prato, garantindo que o óleo cubra o ponto mais alto da gota. Coloque-o em uma incubadora a 37 °C, 6% de CO₂ durante a noite para equilibrar.

2. Coleta de amostras de sêmen

1. Forneça aos pacientes instruções escritas e verbais claras sobre a coleta da amostra de sêmen. Certifique-se de que a coleta da amostra esteja completa e instrua os pacientes a se absterem da ejaculação por 3-7 dias antes da coleta.
2. Colete o sêmen por masturbação em um copo de coleta de esperma especializado descartável, estéril e não tóxico. Certifique-se de que toda a ejaculação seja coletada e instrua o indivíduo a relatar qualquer perda de qualquer fração da amostra.
3. Verifique os nomes, documentos de identificação válidos e impressões digitais do cônjuge do paciente. Marque o nome e o número do prontuário médico do cônjuge do paciente no corpo e na tampa do copo de coleta de esperma.
4. Depois que o paciente do sexo masculino coletar sêmen, entregue a amostra cara a cara entre a equipe e o paciente. Pegue uma pequena quantidade da amostra de sêmen para embalagem e armazenamento. Certifique-se de que o paciente assine na área de embalagem.
5. Numere e armazene os espécimes encapsulados por 2 anos. Registre as informações do paciente, o número de identificação e as assinaturas do receptor e das testemunhas no diário de processamento de sêmen.
6. Se algum membro da equipe do centro reprodutivo descobrir a identidade de um paciente suspeito, pare de receber a amostra e verifique novamente a identidade do paciente. Não receba duas ou mais amostras ao mesmo tempo. Se houver suspeita de confusão nas amostras, pare de recebê-las.

3. Análise da amostra de sêmen

1. Observe a cor das amostras de sêmen.
   NOTA: O sêmen normal parece homogêneo e branco-acinzentado após a liquefação. O sêmen com concentração de espermatozóides muito baixa pode parecer transparente. Se houver glóbulos vermelhos, o sêmen pode parecer marrom-avermelhado. Se o paciente tiver icterícia ou tomar certas vitaminas, o sêmen pode parecer amarelo.
2. Meça o volume de sêmen usando o método de pesagem, com precisão de 0,1 mL.
3. Colocar a amostra de sémen a 37 °C durante 15-30 min. Aspire-o para uma pipeta descartável de plástico de diâmetro largo (aproximadamente 1,5 mm de diâmetro), permitindo que o sêmen caia por gravidade. Observe o comprimento de qualquer fio.
   NOTA: Uma ejaculação liquefeita normal forma gotas pequenas e discretas. Se a viscosidade for anormal, a gota formará um fio com mais de 2 cm.
4. Se o sêmen ainda não liquefazer em 60 minutos, adicione uma quantidade igual de meio de fertilização. Em seguida, inspire e expire repetidamente a mistura usando uma pipeta de transferência de plástico descartável até que ela se liquefaça completamente.
5. Meça o valor do pH do sêmen usando papel de teste de pH de precisão (pH 6,0-10,0).
6. Pegue 10 μL de sêmen totalmente liquefeito e pingue-o em uma câmara de contagem Makler. Avalie a motilidade dos espermatozoides em um campo de 200x com um microscópio óptico. Observe a presença de aglutinação de espermatozóides e células não espermáticas.
7. Avalie a concentração de espermatozoides em um campo de 200x com um microscópio óptico.

4. Coleta de oócitos

1. Prepare um prato para a coleta de oócitos (OPD) no dia anterior à coleta do oócito. Adicione 2,5 mL de meio de processamento de oócitos a uma placa de cultura estéril de 35 mm. Em seguida, adicione 1,5 mL de óleo e coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C durante a noite para equilibrar.
2. Prepare dois pratos para cultura de oócitos (TOC) no dia anterior à coleta de oócitos. Adicione 1 mL de meio de fertilização ao anel interno de uma placa de cultura de poço central estéril e, em seguida, adicione 1 mL de óleo. Adicione 4 mL de meio de fertilização ao anel externo. Coloque o prato em uma incubadora de CO₂ a 37 °C, 6% para equilibrar durante a noite.
3. Ligue todos os aquecedores e placas de aquecimento e meça a temperatura 30 minutos antes da recuperação do oócito.
4. Lave as mãos com desinfetante para as mãos e enxágue abundantemente com água corrente. Use luvas limpas, estéreis e sem poeira.
5. Pré-aqueça a placa de cultura estéril em uma plataforma de aquecimento a 37 °C.
6. Verifique rigorosamente a identidade do paciente antes da coleta do oócito.
7. Inale o fluido folicular em tubos de ensaio estéreis por meio de pressão negativa e, em seguida, entregue-o imediatamente aos embriologistas do laboratório.
8. Despeje todo o fluido folicular em placas de cultura estéreis e procure complexos de cumulus corona de oócitos (OCCCs) sob um estereomicroscópio de baixa ampliação. Pegue os OCCCs usando uma pipeta e coloque-os em um OPD para armazenamento temporário a 37 ° C.
9. Registre a quantidade, cor, número de folículos e número de OCCCs no fluido folicular.
10. Após a recuperação do oócito, transfira os OCCCs para o TOC usando uma pipeta Pasteur estéril. Coloque-os rapidamente em uma incubadora de cultura (37 °C, 6% CO₂, 5% O₂ e umidade saturada) por 2 h.
11. Prepare um prato de quatro poços, adicione 0,5 mL de solução de hialuronidase ao primeiro poço e 1 mL de meio de processamento de oócitos a cada um dos três poços restantes. Incubar a 37 °C durante 1 h.
12. Use uma pipeta Pasteur para transferir OCCCs da etapa 4.10 para uma hialuronidase bem contida por 30 s. Em seguida, transfira os OCCCs para um meio de processamento de oócitos bem contido.
13. Use um tubo de decapagem de oócitos de 150 μm de diâmetro para soprar e aspirar os OCCCs para remover as células da granulosa. Em seguida, use uma nova pipeta Pasteur para transferir os oócitos para o meio de processamento de oócitos para lavagem. Transfira-os para outro TOC pré-equilibrado e coloque-os em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C, 6%.

5. Seleção de espermatozóides e operação ICSI

1. Adicione 5 μL de sêmen à microgota do meio de fertilização no ponto inicial esquerdo da pista em forma de U na placa de operação ICSI, que foi preparada da etapa 1.1 à etapa 1.6.
2. Coloque o prato de operação ICSI em uma incubadora a 37 °C, 6% de CO₂ por 30-60 min.
3. Abra o microscópio invertido, o sistema operacional do microscópio e o stage de aquecimento para garantir que todos os controles operacionais sejam restaurados à sua faixa controlável original, permitindo uma operação suave e confortável.
4. Instale a agulha ICSI no porta-agulhas. Fixe o porta-agulha no micromanipulador, ajuste a agulha de retenção e a agulha de injeção na lente objetiva 4x e ajuste sequencialmente seus ângulos e posições para que as duas agulhas fiquem relativas e paralelas ao palco. Verifique a amplitude de movimento da agulha de operação sob a lente objetiva × 20.
5. Ajuste o ângulo e a posição da agulha de retenção do oócito e da agulha de injeção sob a lente objetiva 4x, de modo que as duas cabeças da agulha fiquem relativas e paralelas ao palco. Mova a agulha de operação para frente, para trás, para a esquerda e para a direita. Verifique a faixa de movimento da agulha de operação sob as objetivas 10x e 20x.
6. Levante a agulha de retenção do oócito e a agulha de injeção para garantir que a altura entre a mesa cirúrgica e a mesa de aquecimento permita a fácil colocação do recipiente cirúrgico sem tocar na agulha operacional.
7. Após a verificação dupla, transfira os oócitos selecionados da etapa 4.12 para microgotículas do meio de processamento de oócitos na placa cirúrgica ICSI, uma por gota.
8. Coloque o prato de operação contendo o oócito no hot stage do operador de microscópio preparado.
9. Ajuste a distância focal do microscópio sob a lente objetiva de 10x para tornar as bordas das microgotículas dentro do prato de operação claras e visíveis.
10. Abaixe a agulha de injeção na tira PVP do prato de operação ICSI. Ajuste o microscópio para tornar a agulha de injeção claramente visível e inale uma pequena quantidade de PVP na agulha de injeção ao mesmo tempo.
11. Mova a agulha de injeção para a tira longa no lado direito da pista em forma de U e extraia espermatozóides de alta qualidade com boa morfologia e motilidade progressiva.
12. Transfira o esperma para a tira de PVP no lado direito e coloque o esperma no fundo do prato de operação.
13. Pressione suavemente a agulha de injeção na seção média ou inferior da cauda do esperma, puxe rapidamente a agulha de injeção para trás e coce o esperma para fazê-lo parar.
14. Inale o esperma da cauda à cabeça para a agulha de injeção.
15. Transfira a agulha de injeção para a gota do meio de processamento do oócito que contém o oócito do lado direito.
16. Abaixe a agulha de retenção do oócito e mova suavemente o oócito para posicionar o primeiro corpo polar às 12 horas, prendendo o oócito.
17. Ajuste a agulha microcirúrgica e a membrana do oócito no mesmo plano horizontal. Empurre o esperma para a ponta da agulha de injeção.
18. Passe verticalmente pela zona pelúcida às 3 horas no oócito e continue a injetar a agulha até atingir o centro do oócito ou cruzar levemente a posição central, com uma leve retração da agulha de injeção.
    NOTA: Quando ocorre refluxo rápido no citoplasma e no esperma, isso indica que a membrana do oócito se rompeu e a aspiração parou.
19. Injete lentamente espermatozóides no citoplasma do oócito e saia da agulha de injeção. A profundidade da injeção de espermatozoides no citoplasma deve ser de cerca de 50% a 75% do diâmetro do oócito.
20. Depois de retirar a agulha de injeção, ajuste a pressão negativa da agulha de retenção do oócito para liberar os oócitos.
21. Repita os passos acima até que todos os ovócitos maduros tenham sido injetados.
22. Transfira a placa ICSI da placa quente do microscópio para o microscópio de dissecação.
23. Remova o prato de cultura de clivagem da incubadora.
24. Transfira o oócito de esperma injetado para uma microgota em uma placa de cultura de clivagem.
25. Colocar a placa de cultura de clivagem de volta numa incubadora a 37 °C, 6% CO₂, 5% O₂ .

6. Preparação de esperma usando o método DGC

1. Adicione 1,5 mL de solução de centrifugação com gradiente de densidade a 45% a um tubo de ensaio de fundo cônico estéril de 15 mL.
2. Adicione lentamente 1,5 mL de solução de centrifugação com gradiente de densidade a 90% no fundo da solução de centrifugação com gradiente de densidade a 45%, mantendo a interface entre os dois líquidos.
3. Adicione suavemente o sêmen liquefeito à solução de centrifugação gradiente e centrifugue a 300 x g por 15 min (à temperatura ambiente).
4. Remova o sobrenadante e adicione aproximadamente 0,5 mL do sedimento espermático restante a 3 mL de meio de fertilização. Sopre e misture bem.
5. Centrifugue à temperatura ambiente a 200 x g durante 5 min.
6. Pipete o sobrenadante e deixe cerca de 0,2 mL de sedimento.
7. Adicione uma quantidade adequada de meio de fertilização para ressuspender o sedimento, conte a concentração e a vitalidade dos espermatozóides e registre. Coloque em uma incubadora de 37 ° C, 6% de CO2 para uso posterior.

7. Detecção da integridade do DNA nuclear do esperma (Método de Dispersão da Cromatina Espermática, SCD)

1. Ajustar a temperatura interior para 20-28 °C antes de realizar a experiência. Retire o kit de reagentes e deixe-o em equilíbrio à temperatura ambiente por 30-60 min.
2. Prepare a solução desnaturante: Pegue 0,8 mL de solução desnaturante concentrada e adicione a 100 mL de água destilada.
3. Prepare a solução de etanol a 70%: Tome 26,65 mL de água destilada e 70,35 mL de etanol anidro para preparar a solução de etanol a 70%.
4. Prepare a solução de etanol a 90%: Tome 9,55 mL de água destilada e 90,45 mL de etanol anidro para preparar a solução de etanol a 90%.
5. Coloque o tubo de agarose de baixo ponto de fusão (contendo 25 μL de solução de agarose de baixo ponto de fusão) em banho-maria a 90-100 °C por 1-2 min até que o gel de agarose esteja completamente derretido. Em seguida, coloque o tubo em banho-maria a 37 °C por 5 min até que a temperatura seja constante.
6. Tome 3-10 μL de sêmen antes do tratamento de otimização e suspensão de espermatozóides após o tratamento de otimização. Adicione-os a diferentes tubos de agarose de baixo ponto de fusão e misture bem.
7. Pegue 30 μL da suspensão de agarose de baixo ponto de fusão contendo esperma e solte-a em uma lâmina de vidro pré-tratada na posição horizontal.
8. Cubra suavemente a lamínula (22 mm x 11 mm de tamanho) com a lâmina, evitando ao máximo a formação de bolhas.
9. Coloque a lâmina de vidro pré-tratada em uma geladeira a 2-8 °C por 4 min, mantendo a lâmina na posição horizontal durante todo o processo. Remova a lâmina de vidro da geladeira e deslize suavemente para remover a tampa de vidro.
10. Mergulhe rapidamente a lâmina de vidro pré-tratada na solução desnaturante por 7 min.
11. Remova a lâmina de vidro pré-tratada e mergulhe-a em água destilada por 5 s.
12. Remova a lâmina de vidro pré-tratada e coloque-a na vertical. Use papel de filtro para absorver quaisquer gotículas de água na superfície da lâmina e evite tocar na área da amostra.
13. Mergulhe a lâmina de vidro pré-tratada no tampão de lise e reaja com precisão por 20 min.
14. Mergulhe os fragmentos pré-tratados na solução de lavagem por 3 min para lavar a solução de lise.
15. Remova a lâmina de vidro pré-tratada e mergulhe-a em uma solução de etanol a 70% por 2 min.
16. Remova a lâmina de vidro pré-tratada e mergulhe-a em uma solução de etanol a 90% por 2 min.
17. Remova a lâmina de vidro pré-tratada e mergulhe-a em solução de etanol anidro por 2 min.
18. Remova a lâmina de vidro pré-tratada e deixe-a secar naturalmente.
19. Prepare a solução de coloração de Wright A e a solução B em um frasco vazio marrom na proporção de 1:1.
20. Coloque a lâmina de vidro pré-tratada horizontalmente e adicione a solução de corante misturada na lâmina, garantindo que a solução de corante cubra toda a lâmina (cerca de 0,5-1 mL de solução de corante).
21. Após a coloração por 5 min, enxágue suavemente a lâmina de vitral com água destilada 10-15 vezes para remover o excesso de agente de coloração.
22. Deixe o vidro secar naturalmente e observe-o sob um microscópio óptico a 400×. Conte mais de 200 espermatozóides e determine a porcentagem de espermatozóides anormais com pequenos anéis de halo, sem anéis de halo e degeneração.

8. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando software disponível comercialmente.
2. Compare o DFI (%) entre sêmen original, DGC e UHS usando o teste de Friedman.
   NOTA: Para comparações em pares de dois métodos, use o teste de postos sinalizados de Wilcoxon. Considere um valor de p ≤ 0,05 como estatisticamente significativo.

Os métodos UHS e DGC foram utilizados para otimizar o tratamento de 21 amostras e comparar o índice de fragmentação do DNA espermático entre os dois métodos. O método que usa a trilha UHS na placa ICSI pode substituir o DGC, o que pode causar danos aos espermatozoides. Espermatozoides de alta qualidade com boa motilidade progressiva nadam suavemente ao longo da borda da trilha em forma de U (Figura 2), tornando mais fácil para a agulha ICSI agarrá-l...

O passo fundamental na separação de espermatozoides de alta qualidade usando o método UHS descrito neste artigo é o estabelecimento de uma faixa UHS com gotículas tampão. Tanto a pista UHS quanto as gotículas tampão são criadas usando sêmen lavado e recebido. A pista UHS orienta o esperma de alta qualidade a nadar livremente e se acumular ao longo da borda da pista, facilitando a coleta. As gotículas tampão reduzem a viscosidade do sêmen, filtrando espermatozoides mortos, de...

Os autores não têm nada a divulgar.

Nenhum.