Стандартизированная мышиная модель экстракорпоральной ударно-волновой терапии, индуцированной регенерацией мягких тканей

В данной статье описана стандартизированная мышиная модель регенерации тканей с помощью ударно-волновой терапии.

Ударно-волновая терапия (УВТ) демонстрирует многообещающие регенеративные эффекты в нескольких различных тканях. Тем не менее, лежащие в основе молекулярные механизмы плохо изучены. Ангиогенез, процесс образования новых кровеносных сосудов, является ведущим фактором регенерации в более мягких тканях, а также недавно обнаруженным эффектом УВТ. Как механический стимул УВТ индуцирует ангиогенез и регенерацию и какие пути в этом участвуют, до конца не изучено. Для дальнейшего улучшения клинического использования УВТ и получения ценной информации о том, как механическая стимуляция может повлиять на ткани и регенерацию тканей, необходима стандартизированная модель УВТ. Настоящим мы описываем стандартизированную, простую в реализации мышиную модель регенерации, вызванной ударно-волновой терапией, с использованием модели ишемии задних конечностей.

Ударно-волновая терапия (УВТ) впервые была введена в клиническую практику как средство разрушения камней в почках с помощью экстракорпорального применения. В 1990-х годах случайное обнаружение утолщения гребня подвздошной кости в рентгеновских записях после повторной литотрипсии выявило костный морфогенный эффект SWT¹. Это вызвало всплеск новых применений в ортопедии. Таким образом, УВТ превратилась в признанный вариант лечения несращения длинных костей, латерального эпикондилита, а также тендинита ахиллова сухожилия 2,3,4,5. Последние данные в настоящее время снова расширяют спектр приспособлений за пределы ортопедии, охватывая более мягкие ткани и нарушения заживления ран ^6,7. Здесь исследования могут показать эффективность УВТ при гетерогенной совокупности состояний, включая, например, эректильную дисфункцию или спастичность после инсульта ^8,9,10.

Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе УВТ, до сих пор не до конца поняты и требуют дальнейших исследований. Уделяя особое внимание сердечно-сосудистым заболеваниям, наша предыдущая работа демонстрирует многообещающий эффект УВТ на мышиной модели инфаркта миокарда. Таким образом, было обнаружено, что ангиогенез является основным фактором регенерации миокарда после SWT¹¹.

Ангиогенез описывает развитие новых сосудов путем проращивания и расщепления ранее существовавших сосудов. В случае травмы эти новые сосуды способствуют восстановлению притока крови к поврежденному участку и тем самым^{регенерации12}.

Таким образом, ангиогенез представляет собой отличительную черту регенерации тканей и потенциальное объяснение эффектов УВТ в более мягких тканях. Тем не менее, регенерация является сложным процессом с многочисленными индукторными и эффекторными механизмами. Несмотря на возможность исследовать их в условиях изолированной клеточной культуры, животные модели лучше всего подходят для имитации этих сложных процессов. Ишемия задних конечностей является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для исследования ангиогенеза и регенерации in vivo¹³. Для поддержки дальнейших исследований регенеративного эффекта УВТ мы представляем осуществимую стандартизированную мышиную модель УВТ при ишемии задних конечностей.

Эксперименты были одобрены комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Инсбрука и Министерством науки Австрии (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Индукция анестезии и постановка операции

1. Подготовьте подходящую среду для процедур с животными: стерилизуйте оборудование, дезинфицируйте поверхности, используйте одноразовые маски, изоляционные халаты и перчатки.
2. Усыпляйте мышей в возрасте 18-12 недель (штамм и пол в зависимости от условий эксперимента) в камере, прикрепленной к изофлурановому вапорайзеру в концентрации 4%.
3. Проверьте достаточную седацию с помощью педали или рефлектора ушной раковины в качестве индикаторов глубокого распознавания боли.
4. Когда животное будет достаточно седативно, выключите подачу изофлурана и введите анальгезии и анестетики в соответствии с утвержденным протоколом ухода за животными и используйте их, например, кетамина гидрохлорид (80 мг/кг массы тела) в качестве анестетика и ксилазина гидрохлорид (5 мг/кг массы тела) в качестве анальгетика внутрибрюшинно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте шприц с внутрибрюшинным препаратом перед помещением животного в анестезиологическую камеру.
5. Исследуйте глубину анестезии через 5 мин после инъекции, оценив рефлекс отмены педали.
6. Нанесите глазную мазь (например, 0,5 г ретинолпальмитата), чтобы избежать повреждения роговицы.
7. Удаляйте волосы в зоне операции и в непосредственной близости от нее, в частности в левой задней конечности и паху. Крем для депиляции можно использовать вместо бритв или триммеров, чтобы избежать травмирования кожи.
8. Зафиксируйте животное в лежачем положении с вытянутыми конечностями на нагревательной пластине с помощью скотча.
9. Продезинфицируйте и очистите область операции 10% повидон-йодом или аналогичным дезинфицирующим средством. Используйте стерильную полевую простыню.

2. Порядок действий

1. Для проведения операции используйте микроскоп с 10-20-кратным увеличением.
2. Сделайте разрез кожи (~1,5 см) проксимальнее коленного сустава с помощью хирургических ножниц.
3. Аккуратно отделите кожу от подлежащих тканей с помощью тупых щипцов.
4. Определите бедренные сосуды. Аккуратно отделите артерию, вену и нерв с помощью щипцов и ножниц.
5. Начиная проксимально на уровне паховой связки, осторожно удалите окружающую соединительную ткань до тех пор, пока артерия не будет оптимально отображена. В качестве дистальной конечной точки должно быть видно артериальное ответвление на подкожную и подколенную артерию.
6. Перевязать проксимальную бедренную артерию на уровне паховой связки с помощью полипропиленового шва 7-0.
7. Окклюзируйте дистальный конец бедренной артерии проксимальнее разветвления на подкожную и подколенную артерию с помощью полипропиленового шва 7-0.
8. Иссекаем сегмент бедренной артерии между дистальным и проксимальным узлами с помощью диатермии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также возможно иссечение бедренной артерии путем разрезания хирургическими ножницами. Тем не менее, использование диатермии окклюзирует сосуд в дополнение к шву в случае отказа узлов.
9. Убедитесь, что бедренная артерия надежно окклюзирована и в области операции не видно кровотечений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать узкое расстояние между кожными швами, чтобы избежать обеззараживания раны ультразвуковым гелем во время нанесения УВТ.
10. Сшить разрез кожи с помощью 5-0 нерассасывающихся нейлоновых нитей с одиночными узлами.
11. Продезинфицируйте операционную область ватными палочками.

3. Применение ударно-волновой терапии

1. Убедитесь, что разрез кожи полностью закрыт.
2. Определение параметров лечения на ударно-волновом аппарате. В данной экспериментальной установке использовалась плотность потока энергии 0,1 мДж/^мм2 с частотой 3 Гц, что в сумме составило 300 импульсов.
   Примечание: Энергетические уровни были взяты из предыдущих результатов¹⁴ с использованием сфокусированной экстракорпоральной ударно-волновой терапии.
3. Нанесите ультразвуковой гель на обрабатываемую область на внутренней стороне бедра для правильного соединения.
4. Убедитесь, что в геле не задерживаются пузырьки воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное соединение с достаточным количеством геля имеет важное значение для адекватного нанесения УВТ. Мелкие пузырьки воздуха внутри геля поглощают ударные волны и уменьшают их действие.
5. Нанесите 300 импульсов, нажимая на ножной переключатель и медленно перемещая аппликатор по бедру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если УВТ не применяется сразу после операции, избегайте возможного поглощения энергии ударной волны из-за повторно отросших волос при удалении перед лечением.
6. После лечения сотрите остатки ультразвукового геля, чтобы предотвратить охлаждение бедра.
7. Переместите животное в клетку для восстановления, подверженную воздействию нагревательной лампы, чтобы избежать переохлаждения.
8. Внимательно наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в себя, и введите дозу 0,05 мг/кг массы тела бупренорфина подкожно для адекватной анальгезии.
9. Ежедневно следите за здоровьем и благополучием животных до полного заживления хирургического разреза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение может быть ограничено одним сеансом или повторяться несколько раз. В этом примере было выполнено одно применение.

4. Измерение кровотока

1. Выполняйте измерение кровотока сразу после операции и в различные моменты времени после нее в зависимости от условий эксперимента.
2. Успокоить животное в камере, прикрепленной к изофлурановому вапорайзеру на 4%.
3. Когда животное получит седативное средство, выключите подачу изофлурана и введите анестетики и анальгетики. В соответствии с утвержденным протоколом ухода за животными и их применения применяют кетамина гидрохлорид (80 мг/кг массы тела) и ксилазина гидрохлорид (5 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно.
4. Исследуйте глубину анестезии через 5 минут после инъекции, оценив рефлекс отмены педали.
5. Используйте глазную мазь (например, 0,5 г ретинолпальмитата), чтобы избежать повреждения роговицы.
6. Зафиксируйте животное в лежачем положении с вытянутыми конечностями на нагревательной пластине с помощью скотча.
7. Тщательно удалите шерсть с обеих задних конечностей.
8. Измерьте перфузию конечностей с помощью лазерного допплера в соответствии с инструкцией производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве основного параметра следует использовать соотношение ишемизированного кровотока конечности и неишемизированной конечности.

Используя этот протокол, можно наблюдать и контролировать значительные различия в перфузии задних конечностей после вмешательства УВТ. Репрезентативные изображения показывают заметную разницу в конечностях, получавших УВТ (Рисунок 1B), по с?...

Ударно-волновая терапия показывает многообещающие результаты в нескольких режимах регенерации мягких тканей. Тем не менее, чтобы еще больше увеличить, улучшить или изолировать эти регенеративные способности, сначала необходимо раскрыть основы регенерации, вызванн?...

Хольфельд Й. и Гримм М. являются акционерами компании Heart Regeneration Technologies GmbH, дочерней компании Медицинского университета Инсбрука, целью которой является продвижение сердечной ударно-волновой терапии (www.heart-regeneration.com). Всем остальным авторам нечего раскрывать.

Это исследование было поддержано неограниченным исследовательским грантом AUVA для JH и CGT.