Un modello murino standardizzato di terapia extracorporea con onde d'urto indotta dalla rigenerazione dei tessuti molli

Questo articolo descrive un modello murino standardizzato di rigenerazione tissutale tramite trattamento con onde d'urto.

La terapia con onde d'urto (SWT) mostra promettenti effetti rigenerativi in diversi tessuti. Tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti sono poco compresi. L'angiogenesi, un processo di formazione di nuovi vasi sanguigni, è uno dei principali motori della rigenerazione nei tessuti più molli, nonché un effetto recentemente scoperto della SWT. Non è del tutto chiaro come lo stimolo meccanico della SWT induca l'angiogenesi e la rigenerazione e quali vie siano coinvolte. Per migliorare ulteriormente l'uso clinico delle SWT e ottenere informazioni preziose su come la stimolazione meccanica può influenzare i tessuti e la rigenerazione dei tessuti, è necessario un modello standardizzato di SWT. Con la presente descriviamo un modello murino standardizzato e facile da implementare di rigenerazione indotta dalla terapia con onde d'urto, utilizzando il modello di ischemia degli arti posteriori.

La terapia con onde d'urto (SWT) è stata introdotta per la prima volta nella pratica clinica come mezzo per disintegrare i calcoli renali attraverso l'applicazione extracorporea. Negli anni '90, un ritrovamento accidentale di ispessimento della cresta iliaca nelle registrazioni a raggi X a seguito di ripetute litotrissia ha rivelato un effetto morfogenico osseo di SWT¹. Ciò ha provocato un'ondata di nuove applicazioni nell'uso ortopedico. La SWT, quindi, si è evoluta in un'opzione di trattamento riconosciuta per le mancate unioni delle ossa lunghe, l'epicondilite laterale e la tendinite di Achille 2,3,4,5. Prove recenti ampliano nuovamente lo spettro degli apparecchi oltre l'ortopedia, ai tessuti più molli e ai disturbi della guarigione delle ferite ^6,7. In questo caso, gli studi hanno potuto dimostrare l'efficacia delle SWT in un insieme eterogeneo di condizioni, tra cui, ad esempio, la disfunzione erettile o la spasticità dopo l'ictus ^8,9,10.

Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base delle SWT non sono ancora completamente compresi e richiedono ulteriori ricerche. Con un focus sulle malattie cardiovascolari, il nostro lavoro precedente dimostra un effetto promettente della SWT in un modello murino di infarto miocardico. In questo modo l'angiogenesi è stata scoperta come un fattore chiave della rigenerazione miocardica dopo SWT¹¹.

L'angiogenesi descrive lo sviluppo di nuovi vasi attraverso la germinazione e la scissione di vasi preesistenti. In caso di lesione, questi nuovi vasi facilitano il ripristino del flusso sanguigno nell'area danneggiata e quindi la rigenerazione¹².

L'angiogenesi, quindi, rappresenta un segno distintivo della rigenerazione tissutale e una potenziale spiegazione per gli effetti delle SWT nei tessuti più molli. Tuttavia, la rigenerazione è un processo complesso con numerosi meccanismi induttori ed effettori. Nonostante la possibilità di studiarli in un ambiente di coltura cellulare isolata, i modelli animali sono i più adatti per emulare questi processi complessi. L'ischemia degli arti posteriori è un modello consolidato per studiare l'angiogenesi e la rigenerazione in vivo¹³. Per supportare ulteriori ricerche sull'effetto rigenerativo delle SWT, presentiamo un modello murino fattibile, standardizzato e di SWT nell'ischemia degli arti posteriori.

Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina di Innsbruck e dal Ministero della Scienza austriaco (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Induzione dell'anestesia e set-up operativo

1. Preparare un ambiente adatto alle procedure per gli animali: sterilizzare le attrezzature, disinfettare le superfici, utilizzare maschere monouso, camici isolanti e guanti.
2. Sedare un topo di 18-12 settimane (ceppo e sesso a seconda dell'impostazione sperimentale) in una camera collegata a un vaporizzatore di isoflurano al 4%.
3. Verificare la presenza di una sedazione sufficiente tramite il pedale o il riflesso del padiglione auricolare come indicatori per il riconoscimento profondo del dolore.
4. Quando l'animale è sufficientemente sedato, disattivare il flusso di isoflurano e somministrare analgesia e anestetici secondo il protocollo approvato per la cura e l'uso degli animali, ad esempio ketamina cloridrato (80 mg/kg di peso corporeo) come anestetico e xilazina cloridrato (5 mg/kg di peso corporeo) come analgetico intraperitoneale.
   NOTA: Preparare la siringa con il farmaco intraperitoneale prima di posizionare l'animale nella camera di anestesia.
5. Esaminare la profondità dell'anestesia 5 minuti dopo l'iniezione valutando il riflesso di ritiro del pedale.
6. Applicare un unguento per gli occhi (ad es. 0,5 g di retinolpalmitat) per evitare danni alla cornea.
7. Rimuovere i peli all'interno e in prossimità dell'area chirurgica, in particolare l'arto posteriore sinistro e l'inguine. La crema depilatoria può essere utilizzata al posto di rasoi o rifinitori per evitare lesioni alla pelle.
8. Fissare l'animale in posizione supina con gli arti estesi su una piastra riscaldante utilizzando del nastro adesivo.
9. Disinfettare e pulire l'area dell'intervento chirurgico con iodio povidone al 10% o disinfettante simile. Utilizzare un telo da campo sterile.

2. Procedura

1. Utilizzare un microscopio con ingrandimento compreso tra 10x e 20x per eseguire l'intervento chirurgico.
2. Praticare un'incisione cutanea (~1,5 cm) prossimale all'articolazione del ginocchio utilizzando le forbici chirurgiche.
3. Separa delicatamente la pelle dal tessuto sottostante usando una pinza smussata.
4. Identificare i vasi femorali. Separa accuratamente arteria, vena e nervo usando pinze e forbici.
5. Iniziando prossimalmente a livello del legamento inguinale, rimuovere con cura il tessuto connettivo circostante fino a quando l'arteria non è visualizzata in modo ottimale. Come punto finale distale, dovrebbe essere visibile la ramificazione arteriosa nell'arteria safena e poplitea.
6. Legare l'arteria femorale prossimale a livello del legamento inguinale utilizzando una sutura in polipropilene 7-0.
7. Occludere l'estremità distale dell'arteria femorale prossimale alla ramificazione in safena e poplitea utilizzando una sutura in polipropilene 7-0.
8. Asportare il segmento dell'arteria femorale tra i nodi distale e prossimale utilizzando la diatermia.
   NOTA: È possibile anche l'asportazione dell'arteria femorale mediante taglio con forbice chirurgica. Tuttavia, l'uso di una diatermia occlude il vaso oltre alla sutura nel caso in cui i nodi falliscano.
9. Assicurarsi che l'arteria femorale sia occlusa in modo sicuro e che non siano visibili sanguinamenti nel campo operatorio.
   NOTA: Si raccomanda una distanza ridotta tra le suture cutanee per evitare la decontaminazione ultrasonica della ferita con gel durante l'applicazione di SWT.
10. Sutura l'incisione cutanea utilizzando suture di nylon 5-0 non assorbibili a nodi singoli.
11. Disinfettare l'area chirurgica con tamponi di cotone.

3. Applicazione della terapia con onde d'urto

1. Assicurarsi che l'incisione cutanea sia completamente chiusa.
2. Definire i parametri di trattamento sul dispositivo a onde d'urto. In questo contesto sperimentale, è stata utilizzata una densità di flusso di energia di 0,1 mJ/mm² a una frequenza di 3 Hz per un totale di 300 impulsi.
   NOTA: I livelli di energia sono stati adottati dai risultati precedenti¹⁴ utilizzando il trattamento con onde d'urto extracorporee focalizzate.
3. Applicare il gel ad ultrasuoni sull'area da trattare all'interno della coscia per un corretto accoppiamento.
4. Assicurati che non ci siano bolle d'aria intrappolate all'interno del gel.
   NOTA: Il corretto accoppiamento con una quantità sufficiente di gel è essenziale per un'adeguata applicazione di SWT. Piccole bolle d'aria all'interno del gel assorbiranno le onde d'urto e ne diminuiranno l'effetto.
5. Applicare 300 impulsi attivando l'interruttore a pedale mentre si muove lentamente l'applicatore sulla coscia.
   NOTA: Se la SWT non viene applicata immediatamente dopo l'intervento chirurgico, evitare il possibile assorbimento di energia delle onde d'urto dovuto alla ricrescita dei peli mediante rimozione prima del trattamento.
6. Dopo il trattamento, rimuovere eventuali residui di gel ultrasonico per evitare il raffreddamento della coscia.
7. Spostare l'animale in una gabbia di recupero esposta a una lampada riscaldante per evitare l'ipotermia.
8. Monitorare attentamente l'animale fino al risveglio e somministrare una dose di 0,05 mg/kg di peso corporeo di buprenorfina, per via sottocutanea per un'adeguata analgesia.
9. Monitorare quotidianamente la salute e il benessere degli animali fino a quando l'incisione chirurgica non è completamente guarita.
   NOTA: Il trattamento può essere limitato a una sessione o ripetuto più volte. In questo esempio è stata eseguita una singola applicazione.

4. Misurazione del flusso sanguigno

1. Eseguire la misurazione del flusso sanguigno immediatamente dopo l'intervento chirurgico e in vari momenti successivi a seconda dell'impostazione sperimentale.
2. Sedare l'animale in una camera collegata a un vaporizzatore di isoflurano al 4%.
3. Quando l'animale è sedato, disattivare il flusso di isoflurano e somministrare anestetici e analgesici. Secondo il protocollo approvato per la cura e l'uso degli animali, applicare ketamina cloridrato (80 mg/kg di peso corporeo) e xilazina cloridrato (5 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale.
4. Esaminare la profondità dell'anestesia 5 minuti dopo l'iniezione valutando il riflesso di ritiro del pedale.
5. Utilizzare un unguento per gli occhi (ad es. 0,5 g di retinolpalmitat) per evitare danni alla cornea.
6. Fissare l'animale in posizione supina con gli arti estesi su una piastra riscaldante utilizzando del nastro adesivo.
7. Rimuovere meticolosamente i peli da entrambi gli arti posteriori.
8. Misurare la perfusione degli arti tramite laser doppler secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Il rapporto tra il flusso sanguigno ischemico degli arti e quello non ischemico degli arti deve essere utilizzato come parametro principale.

Utilizzando questo protocollo, è possibile osservare e monitorare differenze significative nella perfusione degli arti posteriori dopo l'intervento SWT. Le immagini rappresentative mostrano una marcata differenza negli arti trattati con SWT (Figura 1B) rispetto agli arti di controllo non trattati (Figura 1A). Qui, la perfusione è rappresentata tramite svasatura termica con colori freddi che ra...

Il trattamento con onde d'urto mostra risultati promettenti in diversi contesti di rigenerazione dei tessuti molli. Tuttavia, per aumentare, migliorare o isolare ulteriormente queste capacità rigenerative, prima di tutto le basi della rigenerazione indotta da SWT dovrebbero essere scoperte a livello molecolare. La rigenerazione tissutale è complessa e coinvolge molti processi biologici tra cui l'immunità innata e acquisita, l'infiammazione, la progressione del ciclo cellulare, l'apopt...

Holfeld J. e Grimm M. sono azionisti di Heart Regeneration Technologies GmbH, uno spin-off dell'Università di Medicina di Innsbruck che mira a promuovere la terapia con onde d'urto cardiache (www.heart-regeneration.com). Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca AUVA illimitata a JH e CGT.