Esse protocolo pode ajudar a entender os mecanismos de proteção contra ataques autoimunes e identificar alvos terapêuticos para a reposição de células beta no diabetes tipo um. A principal vantagem desta técnica é o custo relativamente baixo, a simplicidade dos métodos de cultura de células, transplante e imagem, bem como a mínima invasividade das técnicas em camundongos. Indivíduos que nunca realizaram uma injeção na veia da cauda antes podem ter dificuldades para inserir a agulha na veia.
Peça uma demonstração por um especialista antes da primeira injeção. Para começar, pegue o rato anestesiado e remova os pelos de seu lado dorsal usando um barbeador elétrico com um protetor, expondo aproximadamente uma polegada por dois centímetros da pele. Devolva o rato raspado à câmara de knockdown.
Antes do transplante, transfira um camundongo de cada vez da câmara para uma superfície limpa equipada com um cone nasal de isoflurano e guie suavemente a cabeça do camundongo para dentro do cone nasal. Limpe a área raspada com uma almofada de preparação de álcool isopropílico para remover os pelos soltos e desinfetar a pele. Em seguida, desenhe mais de 300 microlitros de suspensão celular em uma seringa estéril de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26.
Remova as bolhas da seringa e retenha 300 microlitros de suspensão celular enquanto empurra o excesso. Usando um par de pinças curvas seguradas na mão não dominante, levante suavemente a pele de um lado das costas do mouse para permitir um acesso mais fácil ao espaço subcutâneo. Em seguida, usando a mão dominante, posicione a seringa paralelamente às planícies coronal e sagital do corpo do rato.
Com a agulha apontada para a cabeça do rato, insira-a na pele perto dos quartos traseiros e guie-a para o espaço subcutâneo, garantindo que toda a agulha permaneça sob a pele e não perfure. Ajuste a pinça para segurar a pele ao redor da base da agulha. Dispense lentamente menos de 50 microlitros da suspensão celular e confirme a formação de uma pequena protuberância sob a pele no local da injeção.
Continue injetando até 200 microlitros da suspensão celular por via subcutânea. Em seguida, segurando a pinça no lugar e mantendo a agulha paralela ao corpo do rato, retire a agulha. Uma vez que a agulha é removida, segure a pele fechada com pinça por alguns segundos para evitar que as células vazem para fora da ferida de punção.
Após o transplante, transfira cada camundongo para uma gaiola nova e permita que o animal se recupere totalmente da anestesia antes de adicionar mais camundongos à gaiola. Colocando o rato eutanasiado nas costas, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão vertical de aproximadamente dois centímetros de comprimento na pele. Abra o lado direito do mouse e localize o baço vermelho brilhante.
Corte suavemente o baço longe do pâncreas rosa e transfira-o para uma placa de Petri estéril de 10 centímetros contendo cinco mililitros de PBS estéril. Amasse o baço com a parte superior plana de um êmbolo de seringa estéril. Coloque um filtro de 40 ou 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros e marque-o com cinco mililitros de PBS.
Transfira a suspensão do baço para o coador e amasse-a suavemente. Lave o prato com 10 mililitros de PBS e transfira a lavagem para o coador. Continue amassando até que nenhuma cor vermelha permaneça no coador.
Em seguida, gire o tubo a uma velocidade de 500 G por cinco minutos à temperatura ambiente e remova o sobrenadante com uma pipeta aspiradora antes de ressuspender o pellet de células em cinco mililitros de tampão de lise ACK pré-aquecido à temperatura ambiente para realizar a lise das hemácias à temperatura ambiente por quatro minutos. Apague a reação com cinco mililitros de meio celular NIT-1 por cinco mililitros de tampão de lise e passe a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 50 mililitros através de um filtro fresco para remover aglomerações. Gire o tubo a 500 G durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, ressuspenda o pellet de células em 20 mililitros de PBS antes de contar as células. Após a contagem, gire as células a 500 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet de células em PBS estéril em um tubo de reação de bloqueio seguro de 1,5 mililitro.
Injete imediatamente ou armazene as células no gelo por no máximo uma hora. Aqueça o corpo dos camundongos adultos receptores NOD SCID usando uma lâmpada de calor por cinco a 10 minutos para vasodilatar as veias. Ressuspenda a solução de esplenócito antes de cada injeção.
Para cada rato, retire 100 microlitros da suspensão de esplenócito pré-aquecida na seringa, certifique-se de que não existem bolhas de ar. Em seguida, coloque o mouse no dispositivo de retenção antes de capturar sua cauda com a mão não dominante. Localize uma das duas veias laterais da cauda.
Gire suavemente a cauda, se necessário. Limpe a cauda com um lenço de desinfecção contendo álcool isopropílico a 70%. Usando a mão dominante, insira a agulha em um ângulo agudo na região central da cauda.
Com o bisel da agulha virado para cima, deslize a agulha alguns milímetros através da pele. Em seguida, aplique uma pressão suave na seringa para injetar a suspensão de esplenócitos. Não permita que a agulha se mova mais para dentro ou para fora durante a injeção.
As injeções bem-sucedidas não dão origem a contrapressão durante a injeção e são indicadas por fluxo sanguíneo transparente ou branco imediatamente após a injeção. Após a injeção, solte suavemente a agulha para fora da veia e aplique uma leve pressão na cauda com um lenço de desinfecção até que o sangramento pare. Solte o mouse do dispositivo de retenção e transfira-o suavemente para uma gaiola recém-preparada.
Pelo menos cinco minutos antes da aquisição de imagens, injete o camundongo intraperitonealmente com a dosagem apropriada de solução de D-luciferina usando uma seringa de um mililitro e uma agulha calibre 26. Depois de fazer login no software de geração de imagens, no painel de controle, selecione inicializar. Para salvar automaticamente os dados de imagem, clique em aquisição seguida de salvamento automático e crie as pastas apropriadas no computador.
Quando o instrumento terminar de inicializar, defina o tempo de exposição para um minuto. Coloque o mouse sobre o instrumento de imagem em decúbito ventral com os membros jogados e guie sua cabeça até o cone do nariz. Achate o mouse suavemente pressionando o centro de suas costas com as duas mãos e, em seguida, espalhe-as para fora e afastadas.
Em seguida, no software de imagem, selecione adquirir e registrar quaisquer detalhes relevantes do experimento na janela pop-up. Em dois dos três camundongos estudados, o enxerto controle foi destruído até o 18º dia, como evidenciado pela perda dos respectivos sinais bioluminescentes. No outro camundongo, no entanto, o enxerto mutante foi destruído enquanto o enxerto controle sobreviveu, destacando a variação biológica entre os animais.
O sinal bioluminescente foi quantificado e a sobrevida do enxerto foi relatada como a porcentagem do sinal bioluminescente residual em comparação com o sinal no primeiro momento. A razão entre os sinais luminescentes do enxerto mutante e do enxerto controle para cada camundongo foi utilizada para visualizar a variação entre os animais. Antes da transferência da doença, as células transplantadas podem se replicar, resultando em enxertos expandidos visíveis através da pele.
Aos exames de imagem, esses enxertos exibiam sinais bioluminescentes saturados que não podiam ser quantificados com precisão. Os enxertos podem ser isolados em vários momentos para caracterização das células imunes infiltrantes por, por exemplo, citometria de fluxo para investigar os mecanismos de ataque autoimune e proteção do enxerto.
