小鼠自身免疫性糖尿病过继转移模型中移植物存活的生物发光监测

该协议可以帮助了解预防自身免疫攻击的机制，并确定一型糖尿病β细胞替代的治疗靶点。该技术的主要优点是成本相对较低，细胞培养，移植和成像方法的简单性，以及小鼠技术的最小侵入性。以前从未进行过尾静脉注射的人可能难以将针头插入静脉。

在第一次注射之前要求专家演示。首先，取出麻醉的小鼠，并使用带防护装置的电动剃须刀从其背侧去除毛发，露出大约一英寸乘两英寸的皮肤。将剃光的鼠标放回击倒室。

在移植之前，一次将一只小鼠从腔室转移到配备有异氟醚鼻锥的干净表面上，并轻轻地将小鼠头部引导到鼻锥中。用异丙醇准备垫擦拭剃光区域，以去除松散的头发并对皮肤进行消毒。接下来，将超过 300 微升的细胞悬液吸入装有 26 号针头的一毫升无菌注射器中。

从注射器中取出任何气泡，并保留300微升细胞悬液，同时推出多余的气泡。使用非惯用手握住的一对弯曲的镊子，轻轻抬起小鼠背部一侧的皮肤，以便更容易地进入皮下空间。然后使用惯用手将注射器平行于小鼠身体的冠状和矢状平原。

将针头指向小鼠头部，将其插入后躯附近的皮肤中，并将其引导到皮下空间，同时确保整个针头留在皮肤下并且不会戳穿。调整镊子以保持针根周围的皮肤。慢慢分配少于50微升的细胞悬液，并确认在注射部位的皮肤下形成一个小凸起。

继续皮下注射多达200微升的细胞悬液。然后将镊子固定到位并保持针头与小鼠身体平行，取出针头。拔出针头后，用镊子闭合皮肤几秒钟，以防止细胞从穿刺伤口泄漏。

移植后，将每只小鼠转移到新鲜的笼子中，让动物从麻醉中完全恢复，然后再将其他小鼠添加到笼子中。将安乐死的小鼠放在背上，使用手术剪刀在皮肤上做一个大约两英寸长的垂直切口。切开鼠标的右侧，找到鲜红色的脾脏。

轻轻地将脾脏从粉红色胰腺上切开，并将其转移到含有五毫升无菌PBS的无菌10厘米培养皿中。用无菌注射器柱塞的平顶捣碎脾脏。将 40 或 70 微米的过滤器放在 50 毫升的锥形管上，并用 5 毫升的 PBS 灌注。

将脾脏悬浮液转移到过滤器中并轻轻捣碎。用10毫升PBS清洗盘子，然后将洗液转移到过滤器中。继续捣碎，直到过滤器上没有红色。

然后在室温下以500G的速度旋转试管5分钟，并用吸液管除去上清液，然后将细胞沉淀重悬于预热至室温的5毫升ACK裂解缓冲液中，以在室温下进行红细胞裂解四分钟。每5毫升裂解缓冲液用5毫升NIT-1细胞培养基淬灭反应，并将细胞悬液通过新鲜过滤器进入50毫升离心管以去除团块。在室温下以500G旋转管5分钟。

接下来，在计数细胞之前，将细胞沉淀重悬于20毫升PBS中。计数后，在室温下以500G旋转细胞五分钟。将细胞沉淀重悬于无菌PBS中的1.5毫升安全锁定反应管中。

立即注射或将细胞储存在冰上最多一小时。通过使用加热灯加热5至10分钟来加热成年受体NOD SCID小鼠的身体以血管扩张静脉。每次注射前重悬脾细胞溶液。

对于每只小鼠，将100微升预热的脾细胞悬浮液吸入注射器中，确保不存在气泡。接下来，将鼠标放在约束装置中，然后用非惯用手捕获其尾巴。找到两条侧尾脉之一。

如果需要，轻轻旋转尾巴。用含有70%异丙醇的消毒湿巾擦拭尾部。使用惯用手，将针以锐角插入尾巴的中心区域。

将针头的斜面朝上，将针头在皮肤上滑动几毫米。然后轻轻按压注射器以注射脾细胞悬浮液。注射时不要让针头进一步向内或向外移动。

成功的注射在注射过程中不会产生背压，并且在注射后立即由透明或白色血流指示。注射后，轻轻地将针头从静脉中释放出来，并用消毒湿巾对尾部施加轻微的压力，直到出血停止。将鼠标从约束装置中松开，轻轻地将其转移到新鲜准备好的笼子中。

在成像前至少五分钟，使用一毫升注射器和26号针头腹膜内注射适当剂量的D-荧光素溶液。登录到成像软件后，在控制面板中选择初始化。要自动保存图像数据，请单击采集，然后单击自动保存到并在计算机中创建相应的文件夹。

仪器完成初始化后，将曝光时间设置为一分钟。将鼠标放在成像仪器上，俯卧姿势，四肢张开，并将其头部引导到鼻锥中。用双手按压鼠标背部中心，然后将双手向外分开，轻轻压平鼠标。

然后在成像软件中，选择获取并在弹出窗口中记录实验的任何相关详细信息。在研究的三只小鼠中的两只中，对照移植物在第18天被破坏，这从各自生物发光信号的丢失中可以明显看出。然而，在另一只小鼠中，突变移植物被破坏，而对照移植物存活下来，突出了动物之间的生物学变异。

对生物发光信号进行量化，并报告移植存活率为残留生物发光信号与第一个时间点信号的百分比。使用来自突变移植物的发光信号与每只小鼠的对照移植物的比率来可视化动物之间的变异。在疾病转移之前，移植的细胞可能会复制，导致通过皮肤可见的扩张移植物。

在成像时，这些移植物显示出无法准确量化的饱和生物发光信号。可以在不同的时间点分离移植物，以表征浸润免疫细胞，例如通过流式细胞术来研究自身免疫攻击和移植物保护的机制。