Dieses Protokoll kann helfen, die Mechanismen des Schutzes vor Autoimmunangriffen zu verstehen und therapeutische Ziele für den Betazellersatz bei Typ-1-Diabetes zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik sind die relativ geringen Kosten, die Einfachheit der Zellkultur-, Transplantations- und Bildgebungsmethoden sowie die minimale Invasivität der Maustechniken. Personen, die noch nie eine Schwanzveneninjektion durchgeführt haben, können Schwierigkeiten haben, die Nadel in die Vene einzuführen.
Lassen Sie sich vor der ersten Injektion von einem Experten vorführen. Nehmen Sie zunächst die betäubte Maus und entfernen Sie Haare von ihrer Rückenseite mit einem Elektrorasierer mit einem Schutz, wobei Sie etwa einen Zoll mal zwei Zoll der Haut freilegen. Lege die rasierte Maus in die Knockdown-Kammer zurück.
Übertragen Sie vor der Transplantation jeweils eine Maus aus der Kammer auf eine saubere Oberfläche, die mit einem Isofluran-Nasenkegel ausgestattet ist, und führen Sie den Kopf der Maus vorsichtig in den Nasenkegel. Wischen Sie die rasierte Stelle mit einem Isopropylalkohol-Vorbereitungspad ab, um lose Haare zu entfernen und die Haut zu desinfizieren. Ziehen Sie als Nächstes mehr als 300 Mikroliter Zellsuspension in eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist.
Entfernen Sie alle Blasen aus der Spritze und bewahren Sie 300 Mikroliter Zellsuspension auf, während Sie den Überschuss herausdrücken. Heben Sie mit einer gebogenen Pinzette, die in der nicht-dominanten Hand gehalten wird, die Haut auf einer Seite des Mausrückens sanft an, um einen leichteren Zugang zum Unterhautraum zu ermöglichen. Positionieren Sie dann die Spritze mit der dominanten Hand parallel zu den koronalen und sagittalen Ebenen des Mauskörpers.
Führen Sie die Nadel in Richtung des Kopfes der Maus in die Haut in der Nähe der Hinterhand ein und führen Sie sie in den Unterhautraum, wobei Sie darauf achten, dass die gesamte Nadel unter der Haut bleibt und nicht durchsticht. Stellen Sie die Pinzette so ein, dass die Haut um die Nadelbasis herum gehalten wird. Geben Sie langsam weniger als 50 Mikroliter der Zellsuspension ab und bestätigen Sie die Bildung einer kleinen Ausbuchtung unter der Haut an der Injektionsstelle.
Injizieren Sie weiterhin bis zu 200 Mikroliter der Zellsuspension subkutan. Halten Sie dann die Pinzette an Ort und Stelle und halten Sie die Nadel parallel zum Körper der Maus und ziehen Sie die Nadel zurück. Sobald die Nadel entfernt ist, halten Sie die Haut einige Sekunden lang mit einer Pinzette geschlossen, um zu verhindern, dass die Zellen aus der Stichwunde austreten.
Nach der Transplantation wird jede Maus in einen neuen Käfig gebracht und das Tier kann sich vollständig von der Narkose erholen, bevor weitere Mäuse in den Käfig gesetzt werden. Legen Sie die eingeschläferte Maus auf den Rücken und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen etwa zwei Zentimeter langen vertikalen Schnitt in die Haut. Schneiden Sie die rechte Seite der Maus auf und suchen Sie die leuchtend rote Milz.
Schneiden Sie die Milz vorsichtig von der rosa Bauchspeicheldrüse ab und legen Sie sie in eine sterile 10-Zentimeter-Petrischale mit fünf Millilitern sterilem PBS. Zerdrücken Sie die Milz mit der flachen Oberseite eines sterilen Spritzenkolbens. Stellen Sie ein 40- oder 70-Mikron-Sieb auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie es mit fünf Millilitern PBS.
Die Milzsuspension in das Sieb geben und vorsichtig zerdrücken. Waschen Sie die Schüssel mit 10 Milliliter PBS und geben Sie die Wäsche in das Sieb. Weiter pürieren, bis keine rote Farbe mehr auf dem Sieb verbleibt.
Dann drehen Sie das Röhrchen mit einer Geschwindigkeit von 500 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Aspirationspipette, bevor Sie das Zellpellet in fünf Millilitern auf Raumtemperatur vorgewärmtem ACK-Lysepuffer resuspendieren, um die Lyse der roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur vier Minuten lang durchzuführen. Beenden Sie die Reaktion mit fünf Millilitern NIT-1-Zellmedien pro fünf Milliliter Lysepuffer und geben Sie die Zellsuspension durch ein frisches Sieb in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um Klumpen zu entfernen. Drehen Sie das Röhrchen bei 500 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 Millilitern PBS, bevor Sie die Zellen zählen. Nach dem Zählen drehen Sie die Zellen bei 500 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur herunter. Resuspendieren Sie das Zellpellet in sterilem PBS in einem 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Reaktionsgefäß.
Entweder sofort injizieren oder die Zellen maximal eine Stunde auf Eis lagern. Erwärmen Sie den Körper der erwachsenen NOD-SCID-Mäuse mit einer Wärmelampe für fünf bis 10 Minuten, um die Venen zu erweitern. Resuspendieren Sie die Splenozytenlösung vor jeder Injektion.
Ziehen Sie für jede Maus 100 Mikroliter der vorgewärmten Splenozytensuspension in die Spritze und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Setzen Sie als Nächstes die Maus in die Rückhaltevorrichtung ein, bevor Sie ihren Schwanz mit der nicht dominanten Hand erfassen. Lokalisieren Sie eine der beiden seitlichen Schweifadern.
Drehen Sie den Schwanz bei Bedarf vorsichtig. Wischen Sie den Schwanz mit einem Desinfektionstuch ab, das 70%igen Isopropylalkohol enthält. Führen Sie die Nadel mit der dominanten Hand in einem spitzen Winkel in den mittleren Bereich des Schwanzes ein.
Schieben Sie die Nadel mit der Abschrägung der Nadel nach oben einige Millimeter durch die Haut. Üben Sie dann sanften Druck auf die Spritze aus, um die Splenozytensuspension zu injizieren. Achten Sie darauf, dass sich die Nadel beim Injizieren nicht weiter nach innen oder außen bewegt.
Erfolgreiche Injektionen verursachen keinen Gegendruck während der Injektion und werden durch einen transparenten oder weißen Blutfluss unmittelbar nach der Injektion angezeigt. Lösen Sie nach der Injektion die Nadel vorsichtig aus der Vene und üben Sie mit einem Desinfektionstuch leichten Druck auf den Schwanz aus, bis die Blutung aufhört. Lösen Sie die Maus von der Rückhaltevorrichtung und setzen Sie sie vorsichtig in einen frisch vorbereiteten Käfig um.
Mindestens fünf Minuten vor der Bildgebung wird der Maus mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 26-Gauge-Nadel die entsprechende Dosierung der D-Luciferin-Lösung intraperitoneal injiziert. Nachdem Sie sich bei der Imaging-Software angemeldet haben, wählen Sie in der Systemsteuerung die Option Initialisieren. Um die Bilddaten automatisch zu speichern, klicken Sie auf Erfassung, gefolgt von automatischem Speichern unter, und erstellen Sie die entsprechenden Ordner auf dem Computer.
Sobald das Gerät mit der Initialisierung fertig ist, stellen Sie die Belichtungszeit auf eine Minute ein. Legen Sie die Maus in Bauchlage mit gespreizten Gliedmaßen auf das Bildgebungsinstrument und führen Sie den Kopf in den Nasenkegel. Glätten Sie die Maus vorsichtig, indem Sie mit beiden Händen auf die Mitte ihres Rückens drücken und dann die Hände nach außen und auseinander spreizen.
Wählen Sie dann in der Bildgebungssoftware im Popup-Fenster die Option Erfassung und Aufzeichnung aller relevanten Details des Experiments. Bei zwei der drei untersuchten Mäuse war das Kontrolltransplantat an Tag 18 zerstört, was sich am Verlust der jeweiligen Biolumineszenzsignale zeigte. Bei der anderen Maus wurde das mutierte Transplantat jedoch zerstört, während das Kontrolltransplantat überlebte, was die biologische Variation zwischen den Tieren verdeutlicht.
Das biolumineszente Signal wurde quantifiziert und das Transplantatüberleben wurde als Prozentsatz des verbleibenden biolumineszenten Signals im Vergleich zum Signal zum ersten Zeitpunkt angegeben. Das Verhältnis der Lumineszenzsignale vom mutierten Transplantat zum Kontrolltransplantat für jede Maus wurde verwendet, um die Variation zwischen den Tieren zu visualisieren. Vor der Übertragung der Krankheit können sich die transplantierten Zellen vermehren, was zu ausgedehnten Transplantaten führt, die durch die Haut sichtbar sind.
Bei der Bildgebung zeigten diese Transplantate gesättigte biolumineszente Signale, die nicht genau quantifiziert werden konnten. Transplantate können zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert werden, um die infiltrierenden Immunzellen zu charakterisieren, z. B. durch Durchflusszytometrie, um die Mechanismen des Autoimmunangriffs und des Transplantatschutzes zu untersuchen.
