Nosso protocolo de PLA permite identificar e quantificar a interação endógena entre proteínas nos sítios de contato com a membrana. Nós o usamos para estudar a interação entre duas proteínas do retículo endoplasmático em sítios de contato mitocondrial do retículo endoplasmático. Esta técnica combina PLA com colorações de organelas e análise de distâncias de organelas.
Permite localizar e quantificar a interação entre proteínas nos sítios de contato inter-organelas. Depois de realizar o ensaio de ligadura de proximidade, ou PLA, e aquisição de imagem, configure o software de análise de células para iniciar o MATLAB e iniciar uma extensão clicando na opção Imaris no sistema operacional Mac ou no menu de edição no Windows. Selecione as preferências, altere para o painel de ferramentas personalizadas e defina o caminho.
Para importar as imagens para o software, converta as imagens da pilha confocal em um arquivo IMS, diretamente através da seção arena ou usando o conversor de arquivos autônomo que permite a conversão em lote. Após a importação, clique em editar, vá para propriedades da imagem e selecione a geometria da imagem para verificar a calibração da imagem. Verifique se o tamanho do voxel corresponde ao tamanho de pixel esperado para a imagem real em X e Y, e a etapa aplicada pelo microscópio para gerar a pilha Z em Z.To ajustar o contraste dos diferentes canais, clique em Editar no menu, vá para o ajuste de exibição e selecione Mostrar ajuste de exibição.
Ajuste cada canal independentemente para otimizar a exibição de cada cor. Esta etapa é essencial para definir limites precisos ou detectar objetos fracos. Em seguida, clique em editar e selecione cortar 3D para limitar a análise a uma única célula cortando a imagem.
Para analisar outra célula no mesmo campo de visão, abra a mesma imagem novamente e corte-a de forma diferente. Detecte os sinais PLA gerados no local da interação ORP5 e ORP8 clicando na opção adicionar novos pontos, que cria um novo conjunto de objetos e abre o assistente de detecção de pontos. Selecione o canal no qual a detecção de ponto deve ser executada.
Ajuste o diâmetro XY estimado para ajudar o algoritmo de detecção de ponto a encontrar os objetos de interesse. Se o valor escolhido for muito alto, os objetos próximos se fundirão e, se o valor for muito pequeno, sinais aberrantes podem ser detectados. Agora, clique na subtração de fundo para remover o fundo da imagem antes da detecção de pontos para melhorar o contraste local em torno dos objetos de interesse.
Ajuste o limite de detecção de ponto mantendo a qualidade como o parâmetro de limite no limite automático de software ou modifique ligeiramente esse valor para detectar todos os objetos. Quando a detecção de pontos estiver concluída, salve os parâmetros de detecção e reutilize-os para processar outras imagens. Em seguida, detecte a rede mitocondrial para gerar uma renderização de superfície clicando em adicionar novas superfícies para criar um novo objeto e abra o assistente de detecção de superfície.
Selecione o canal no qual a criação da superfície deve ser executada. Aplique o filtro gaussiano para obter uma superfície mais lisa clicando na caixa de seleção lisa e definindo um limite indicando os pequenos detalhes observáveis na superfície. Em seguida, realizar uma subtração de fundo para melhorar os contrastes locais e ajustar o limiar para detectar a rede mitocondrial com base na intensidade do sinal.
Aplique um filtro na superfície para remover pequenos resíduos do limite selecionando o filtro de número de voxels na janela classificar superfície e jogue com os limites superior e inferior para manter apenas os objetos de interesse. Quando a criação da superfície terminar, salve os parâmetros de criação e reutilize-os para processar outras imagens. Para gerar um mapa de distância fora da superfície mitocondrial criada, selecione a superfície mitocondrial na caixa da árvore de cena.
Clique em processamento de imagem e selecione a função de superfícies, seguida de transformação de distância. Uma extensão MATLAB pedindo ao usuário para escolher se o mapa deve ser computado fora ou dentro da superfície do objeto aparecerá. Selecione o objeto de superfície externa para medir a distância entre os pontos de PLA e a superfície da mitocôndria.
Uma vez que o mapa é gerado, ele aparece como um novo canal no painel de ajuste de exibição. Neste canal, cada pixel tem um valor correspondente à distância à mitocôndria mais próxima. Selecione os pontos previamente gerados na caixa da árvore de cena para medir a distância de cada ponto até a mitocôndria mais próxima, e identifique e visualize as mais próximas.
Agora, selecione valores específicos e intensidade do centro do canal correspondente ao mapa de distância nas estatísticas e log detalhado para medir o valor de cada centro de ponto, que corresponde à sua distância para o mais próximo da mitocôndria no mapa de distância. Exporte os dados como um arquivo CSV clicando no ícone de disquete na parte inferior esquerda da janela. Para extrair uma subpopulação de manchas com base em suas distâncias para as mitocôndrias, selecione os pontos na árvore de cenas e clique na guia filtros.
Adicione um novo filtro com base na intensidade central do canal correspondente ao mapa de distância nesta janela e extraia os pontos a menos de 380 nanômetros de distância da mitocôndria, definindo o limite inferior para zero micrômetros e o limite superior para 0,380 micrômetros. Execute uma etapa de duplicação pressionando o botão de seleção duplicada para novos pontos para se concentrar nos pontos selecionados. Imagens confocais de PLA ORP5-ORP8 endógeno mostraram interações nas células HeLa nos subdomínios RE reticular, RE cortical e RE em contato próximo com mitocôndrias, comumente referidas como membranas de RE associadas à mitocôndria.
A análise de imagens 3D revelou que cerca de 50% das interações endógenas ORP5-ORP8 PLA foram detectadas em membranas de RE associadas à mitocôndria. A porcentagem de interações ORP5-ORP8 PLA que ocorrem nas membranas de RE associadas à mitocôndria em células que co-superexpressam ORP5 e ORP8 foi semelhante àquela observada em células onde essas proteínas foram expressas em níveis endógenos. A downregulation de ORP5 e ORP8 induziu uma diminuição maciça no número total de sinais de PLA, enquanto sua co-superexpressão aumentou o PLA.
Sinais de PLA foram detectados nos casais ORP5-PTPIP51 e ORP8-PTPIP51, e seus números médios foram semelhantes ao par ORP5-ORP8 PLA, confirmando a localização de ORP5 e ORP8 nos sítios de contato da membrana ER-mitocôndria. Além disso, a interação de ORP5-ORP8 PLA em contatos da membrana plasmática de ER em um local de contato de três vias entre mitocôndrias, RE e gotículas lipídicas é identificada usando células HeLa transfectadas com PHPLCD-RFP ou mCherry-PLN1. Como em qualquer método de análise de imagem, a qualidade da imagem é um ponto chave, de modo que a otimização do sinal é decisiva para a detecção automática dos objetos.
Esta técnica também pode ser usada para estudar as associações entre duas ou múltiplas organelas celulares, como fizemos em nosso estudo recente sobre a função de ORP5 e ORP8 nos sítios de contato de três partes de RE, mitocôndrias, gotículas lipídicas. Esta técnica pode ser útil em outros estudos no campo da comunicação intracelular para identificar novas associações multipartites inter-organelas.
