Este protocolo nos permite monitorar complexos de mitofagia endógena em tecidos humanos, como células beta, facilitando a pesquisa de mitofagia em tecidos relevantes para a tradução. Uma vantagem dessa técnica é sua capacidade de visualizar importantes complexos mitofagias in vivo em tecidos com uma rara disponibilidade ou em pequenos números amostrais. Após o isolamento de acordo com os protocolos padrão, a cultura de quatro a seis vezes 10 a 3 equivalentes de ilhotas humanas em 10 mililitros de meio de ilhota pancreática completa por pelo menos um dia a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, use um microscópio de luz de dissecção em uma ampliação três vezes maior para contar ilhotas humanas individuais dentro da cultura. Escolha 40 ilhotas por tratamento ou condição de interesse em tubos de 1,5 mililitro de meio de ilhota. Sedimentar as ilhotas por centrifugação e resuspensar a pelota em um mililitro de PBS suplementado com 50 micromolar PR619.
Inverta o tubo e colete as ilhotas por centrifugação para uma segunda lavagem em PBS fresco mais inibidor de deubiquitinase. Após a segunda centrifugação, dissocia as ilhotas em células únicas com 125 microliters de 0,25% de trippsina mais inibidor por três minutos a 37 graus Celsius com tubulação suave periódica. No final da incubação, prenda a reação com um mililitro de 37 graus Celsius aquecido meio de ilhota pancreática complementada com PR619.
Recolher as ilhotas por centrifugação para duas lavagens em PBS fresco mais inibidor por lavagem. Após a segunda lavagem, resuspenja as ilhotas dissociadas em 150 microliters de PBS fresco mais inibidor. Para a adesão e fixação das ilhotas individuais, citospine a solução celular em lâminas de microscópio carregadas fosca e delineie a área celular com uma caneta hidrofóbica.
Em seguida, fixar as células cercadas com 4% de paraformaldeído e PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Para análise imunohistoquímica das amostras de ilhotas, lave as células com duas lavagens de cinco minutos em PBS à temperatura ambiente, seguida por bloqueio de ligação não específico com soro de burro de 10% e PBS mais detergente de 0,3% durante uma hora a temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, coincuba as células com anticorpo de rato primário contra peptidase 8 específica da ubiquitina, anticorpo de coelho primário contra proteína de degradação do receptor de neuregulina-1, e um marcador específico para identificação de células beta que não foi levantado em camundongos ou coelhos para não interferir com o sinal de ensaio de liga de proximidade durante a noite em quatro graus Celsius.
Na manhã seguinte, lave as amostras com duas lavagens de cinco minutos na PBS em um roqueiro. Adicione anticorpo secundário Cy5 anti-cabra a uma solução de ensaio de ligadura de proximidade recém-preparada. Após a segunda lavagem, rotule cada amostra de ilhota com 20 microliters de solução de sonda e recupere os slides com filme plástico para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius.
No final da incubação, lave as células com duas lavagens de cinco minutos no tampão A em um roqueiro seguido de incubação com 20 microliters de solução de ligadura recém-preparada complementadas com 0,25 unidades por microliter de ligase por slide para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da ligadura, lave as células duas vezes com tampão A por dois minutos por lavagem. Cubra cada amostra com 20 microliters de soluções de amplificação complementadas com polimerase para uma incubação de 100 a 120 minutos a 37 graus Celsius.
Para preparar as células para a imagem, lave as amostras duas vezes em tampão fresco A por 10 minutos por lavagem em um roqueiro seguido de uma lavagem em 0,1x tampão B por dois minutos no roqueiro. Após a última lavagem, monte os slides com uma gota de meio de montagem contendo DAPI e coloque cuidadosamente uma mancha sobre cada amostra usando um bisturi para pressionar quaisquer bolhas. Em seguida, sele as tampas com esmalte claro ao redor das bordas.
Para imaginar as amostras, coloque um slide no palco de um microscópio capaz de capturar vários planos focais e selecione a ampliação 100 vezes. Ajuste a altura da pilha Z para aproximadamente 0,45 micrômetros e os parâmetros de emissão de manchas, contra-manchas e células vivas apropriadas. Obtenha pelo menos nove imagens diferentes do plano focal.
Para garantir que os sinais de fundo de imagem da fluorescência e a luz perdida sejam minimizados, processe as imagens utilizando um algoritmo vizinho de desconvolução bidimensional mais próximo usando um software padrão de processamento de imagem de escolha. Para quantificar as interações de ensaio de ligadura de proximidade, abra ImageJ e abra a imagem do ensaio de ligadura de proximidade. A partir da primeira imagem em foco, clique em Imagem e selecione Ajustar e Limiar.
Ajuste o limiar para remover todo o sinal de ensaio de ligadura de proximidade não específico e anote o ajuste do limiar para tentar manter o sinal consistente durante toda a análise. Clique em Processar e selecione Binário e Tornar Binário. Confirme que o tamanho está definido como zero ao infinito, Circularidade está definido de zero a um, Mostrar é definido para Contornos e verificar os resultados do Display e caixas de resultados Claros.
Observe o número de partículas analisadas em uma planilha denotando a amostra e a posição de pilha Z. Em seguida, clique em Analisar e Analisar partículas para medir as partículas. Quando todas as pilhas Z em foco para a amostra tiverem sido analisadas, envie o número total de partículas para a amostra na planilha para quantificar o número total de interações.
Os anticorpos utilizados no ensaio de proximidade são específicos para os ligantes e não demonstram qualquer sobreposição. Como observado, o protocolo de dispersão é altamente eficiente na obtenção de células únicas no campo de visão do microscópio para análise a jusante e a coloração de células beta é mantida após a coloração do ensaio de ligadura de proximidade em ilhotas humanas primárias. Utilizando as técnicas demonstradas, pode-se determinar que a interação da proteína de degradação do receptor de neuregulina-1 e da peptidase 8 específica da ubiqutina é diminuída após uma exposição de 48 horas à palmitato, destacando a viabilidade deste ensaio para avaliar os principais fatores de mitofagia endógena após estímulos diabetogênicos.
A dispersão eficiente e suave das ilhotas humanas é essencial para garantir a quantificação das populações celulares corretas rio abaixo. O PLA permite a avaliação de importantes complexos mitofagiados em amostras de ilhotas humanas permitindo a análise de mitofagia e amostras de pacientes humanos biologicamente importantes movendo o campo da pesquisa sobre diabetes para a frente.
