Nosso achado sugere que a otimização do ambiente espacial de cocultura de cardiomioceste de células endoteliais é necessária para fornecer um modelo in vitro favorável para testar o papel das células endoteliais na proteção cardiomiocócica contra lesão de reprofusão de isquemia simulada. Modelos de cocultura celular têm sido usados extensivamente para investigar o papel das interações célula-célula na função celular e diferenciação. No entanto, tratamentos separados entre tipos celulares e análise a jusante de um único tipo de célula não são facilmente viáveis na cocultura mista.
O presente estudo teve como objetivo criar duas camadas celulares separadas com uma distância significativa entre elas onde se pode induzir lesão por reprofusão de hipóxia e estudar o resultado e os efeitos em um único tipo de célula. Comece a preparação descongelando ambas as linhas celulares. Emplaque as células em frascos T25 depois de lavá-las com mídia fresca.
No dia seguinte, refresque as células com mídia e use quando confluente. Manter a incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 21% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 74% de nitrogênio. Mantenha-o umidificado.
Estime a confluência da linha celular cardiomiócito sob um microscópio leve. Remova a mídia dos frascos contendo culturas celulares confluentes e tente com três a cinco mililitros de trypsin-EDTA por frasco. Agitar o frasco suavemente e incubar a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos.
Depois disso, avalie o progresso enzimático sob um microscópio leve. Após o desprendimento, inative a solução de trippsina adicionando a solução trysin ou celular a um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de mídia por frasco T25. Centrifugar a suspensão celular a 120 x g por dois minutos para obter uma pelota de célula macia.
Após a centrifugação, remova o supernasce e resuspense a pelota em cinco mililitros de mídia. Em seguida, realize a contagem de células e confirme a viabilidade celular. Misture e aliquot de 10 microlitres de células resuspended e 10 microliters de corante azul tripano, em seguida, conte as células vivas usando um contador celular.
Diluir as células com novas mídias regulares para alcançar as densidades de semeadura desejadas. Leve uma placa de 24 poços pré-reveste-a com matriz extracelular e cardiomiócitos de placa em densidades de semeadura de 300.000 por poço na parte inferior da placa. Mantenha as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite.
Após 24 horas, as células endoteliais da placa em inserções a uma densidade ideal de revestimento de 100.000 por inserção. Após 24 horas de revestimento de células endoteliais, coloque as pastilhas de células endoteliais dentro dos poços de cardiomiócito e inicie a co-cultura. Permitir que as células co-cultura por 12 a 24 horas antes de realizar os experimentos.
Prepare a mídia hipóxica despejando aproximadamente 25 mililitros de mídia em um tubo cônico de 50 mililitros. Aersse a parte superior com uma membrana de silicone e use uma pipeta esterilizada para furar um orifício. Depois disso, crie outro buraco e deixe aproximadamente 2/3 das pipetas submersas na mídia.
Lave a mídia com gás hipóxico por cinco minutos a uma vazão de 30 litros por minuto, depois descarte a mídia das placas de 24 poços ou inserções de cultura contendo células anexadas. Lave-os muito suavemente com 100 microliters de 10%PBS por bem adicione 500 microliters da mídia hipoxica recém-preparada a cada poço das placas ou pastilhas. Substitua a mídia original por mídia normal fresca contendo glicose e soro no grupo de controle normoxic.
Coloque uma placa de Petri cheia de água estéril na câmara de hipóxia para umidificar a câmara. Em seguida, coloque as placas contendo os grupos hipóxicos na câmara. Lave a câmara de hipóxia com gás hipóxico por cinco minutos a um fluxo de 30 litros por minuto.
Depois disso, coloque a câmara dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a hipóxia, descarte a mídia antiga das placas ou pastilhas e adicione 500 microliters de mídia normal contendo glicose e soro em cada parede das placas, em seguida, armazene as placas dentro de uma incubadora em condições normais de cultura por duas horas para imitar a reperfusão. Transfira a mídia de cultura celular da placa de 24 poços em uma placa de 96 poços, em seguida, pegue 200 microliters de mídia de cada poço da placa de 24 poços e igualmente distribuído em quatro poços da placa de 96 poços.
Meça a absorvância para LDH usando um kit de ensaio de citotoxicidade em uma placa de 96 poços e siga as instruções do fabricante para determinar o grau de lesão celular. Neste estudo, foram avaliados três tipos de inserções. Todas as três pastilhas tinham o mesmo tamanho de poros de 0,4 micrômetros.
A única diferença entre eles foi a inserção para a altura base, permitindo que as distâncias entre as duas camadas celulares co-cultivadas sejam de 0,5, 1,0 e 2,0 milímetros. Usando este protocolo, as células foram cultivadas sob condições normais de oxigênio e, em seguida, divididas em dois grupos um grupo de controle normóxico e o grupo de hipóxia. Após 24 horas, ambos os grupos foram atualizados com a mídia e cultivados sob condições normais de oxigênio por mais duas horas antes de realizar os ensaios de ponto final.
Uma comparação dos três tipos de inserções culturais na avaliação da liberação de lactato desidrogenase apenas para cardiomiócito, células endoteliais, e co-cultura de cardiomiócito com células endoteliais é mostrada aqui sob condições normóxicas, apenas hipoxia e reoxigenação de hipóxia. Com uma distância de 0,5 milímetros entre as camadas celulares, a hipóxia levou a um aumento significativo da liberação de LDH em comparação com a normoxia quando os cardiomócitos foram cultivados sozinhos. No entanto, o LDH só aumentou ligeiramente no grupo de reoxigenação de hipóxia em comparação com o grupo apenas de hipóxia.
Quando as células endoteliais e os cardiomiócitos foram co-cultivados juntos, o aumento da liberação de LDH sob as condições apenas de hipóxia não foi atenuado. Isso indica que as células endoteliais não apresentaram nenhum efeito protetor em comparação com o grupo de cardiomiócitos apenas sob as condições de hipóxia. No entanto, as células endoteliais exerciam proteção leve, mas significativa, nos cardiomiócitos durante o RH. Quando a distância entre as camadas celulares era de um milímetro, a liberação de LDH também foi significativamente aumentada em cardiomiócitos apenas sob a condição de hipoxia.
No entanto, ao contrário da inserção de 0,5 milímetros, o aumento do LDH nos cardiomiócitos só foi potencializado pelo RH sobre as condições apenas de hipóxia. Esse aumento foi ainda mais acentuado com a inserção de dois milímetros. A concentração de células endoteliais emplacaram em inserções de dois milímetros foi titulada para 25.000, 50,000 e 100.000 células por inserção, respectivamente.
verificou-se que o aumento da intensidade das células endoteliais na cocultura levou a uma atenuação dependente de dose da liberação de LDH causada pelo RH. No entanto, esse efeito não foi visto em condições normóxias. Essa metodologia de cocultura não se limita às células endoteliais e cardiomiócitos. Esses métodos devem auxiliar na investigação de interações células-células específicas entre linhas celulares variadas entre múltiplos órgãos de interesse.
