Nuestro hallazgo sugiere que la optimización del entorno espacial de cocultivo de cardiomiocitos de células endoteliales es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las células endoteliales en la protección de cardiomiocitos contra la lesión por reprofusión de isquemia simulada. Los modelos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para investigar el papel de las interacciones célula-célula en la función y diferenciación celular. Sin embargo, los tratamientos separados entre tipos de células y el análisis posterior de un solo tipo de célula no son fácilmente factibles en el cocultivo mixto.
El estudio actual tuvo como objetivo crear dos capas celulares separadas con una distancia significativa entre ellas donde se puede inducir una lesión por hipoxia de reprofusión y estudiar el resultado y los efectos en un solo tipo de célula. Comience la preparación descongelando ambas líneas celulares. Coloque las células en matraces T25 después de lavarlas con medios frescos.
Al día siguiente, actualice las celdas con medios y úselos cuando sean confluentes. Mantenga la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con 21% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 74% de nitrógeno. Manténgalo humidificado.
Estimar la confluencia de la línea celular de los cardiomiocitos bajo un microscopio de luz. Retire los medios de los matraces que contienen cultivos celulares confluentes y tripsinize con tres a cinco mililitros de tripsina-EDTA por matraz. Agitar el matraz suavemente e incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos.
Después de eso, evalúe el progreso enzimático bajo un microscopio de luz. Después del desprendimiento, inactive la solución de tripsina agregando la trysina o la solución celular a un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medios por matraz T25. Centrifugar la suspensión celular a 120 x g durante dos minutos para obtener un pellet de célula blanda.
Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de un medio. A continuación, realice el recuento de células y confirme la viabilidad celular. Mezcle y alícuota de 10 microlitros de células resuspendidas y 10 microlitros de colorante azul de tripano, luego cuente las células vivas usando un contador celular.
Diluya las células con medios regulares frescos para lograr las densidades de siembra deseadas. Tome una placa de 24 pocillos previamente recubierta con matriz extracelular y cardiomiocitos de placa a densidades de siembra de 300, 000 por pozo en la parte inferior de la placa. Mantenga las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante la noche.
Después de 24 horas, las células endoteliales de la placa en insertos a una densidad óptima de recubrimiento de 100, 000 por inserto. Después de 24 horas de recubrimiento de células endoteliales, coloque insertos de células endoteliales dentro de los pocillos de cardiomiocitos e inicie el cocultivo. Permita que las células coculten durante 12 a 24 horas antes de realizar los experimentos.
Prepare los medios hipóxicos vertiendo aproximadamente 25 mililitros de medios en un tubo cónico de 50 mililitros. Selle al aire la parte superior con una membrana de silicona y use una pipeta esterilizada para perforar un agujero. Después de eso, cree otro orificio y deje aproximadamente 2/3 de las pipetas sumergidas en el medio.
Enjuague el medio con gas hipóxico durante cinco minutos a un caudal de 30 litros por minuto, luego deseche los medios de las placas de 24 pocillos o insertos de cultivo que contienen células adheridas. Lávelos muy suavemente con 100 microlitros de 10% PBS por pozo agregue 500 microlitros de los medios hipóxicos recién preparados a cada pocillo de las placas o insertos. Reemplace el medio original con medios normales frescos que contengan glucosa y suero en el grupo de control normóxico.
Coloque una placa de Petri llena de agua estéril en la cámara de hipoxia para humidificar la cámara. Luego coloque las placas que contienen los grupos hipóxicos en la cámara. Enjuague la cámara de hipoxia con gas hipóxico durante cinco minutos a un flujo de 30 litros por minuto.
Después de eso, coloque la cámara dentro de una incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la hipoxia, deseche los medios viejos de las placas o insertos y agregue 500 microlitros de medios normales que contengan glucosa y suero a cada pared de las placas, luego almacene las placas dentro de una incubadora en condiciones normales de cultivo durante dos horas para imitar la reperfusión. Transfiera los medios de cultivo celular de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos, luego tome 200 microlitros de medios de cada pozo de la placa de 24 pocillos y distribuya equitativamente en cuatro pozos de la placa de 96 pocillos.
Mida la absorbancia de LDH utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad en una placa de 96 pocillos y siga las instrucciones del fabricante para determinar el grado de lesión celular. En este estudio, se evaluaron tres tipos de insertos. Los tres insertos tenían el mismo tamaño de poro de 0,4 micrómetros.
La única diferencia entre ellos fue la altura del inserto a la base, lo que permitió que las distancias entre las dos capas celulares cocultivadas fueran de 0.5, 1.0 y 2.0 milímetros. Usando este protocolo, las células se cultivaron en condiciones normales de oxígeno y luego se dividieron en dos grupos, un grupo de control normóxico y el grupo de hipoxia. Después de 24 horas, ambos grupos se actualizaron con medios y se cultivaron en condiciones normales de oxígeno durante otras dos horas antes de realizar los ensayos de punto final.
Una comparación de los tres tipos de insertos de cultivo para evaluar la liberación de lactato deshidrogenasa para cardiomiocitos solos, células endoteliales solas y cocultivo de cardiomiocitos con células endoteliales se muestra aquí en condiciones normóxicas, hipoxia solamente y reoxigenación por hipoxia. Con una distancia de 0,5 milímetros entre las capas celulares, la hipoxia condujo a un aumento significativo de la liberación de LDH en comparación con la normoxia cuando los cardiomiocitos se cultivaron solos. Sin embargo, la LDH solo aumentó ligeramente en el grupo de reoxigenación por hipoxia en comparación con el grupo de solo hipoxia.
Cuando las células endoteliales y los cardiomiocitos se cocultivaron juntos, el aumento de la liberación de LDH en condiciones de hipoxia solamente no se atenuó. Esto indica que las células endoteliales no tuvieron ningún efecto protector en comparación con el grupo de cardiomiocitos solos bajo las condiciones de hipoxia solamente. Sin embargo, las células endoteliales ejercieron una protección leve pero significativa sobre los cardiomiocitos durante la FC. Cuando la distancia entre las capas celulares era de un milímetro, la liberación de LDH también aumentó significativamente en los cardiomiocitos solo bajo la condición de hipoxia solamente.
Sin embargo, a diferencia del inserto de 0,5 milímetros, el aumento de la LDH en los cardiomiocitos solo fue potenciado por la FC sobre las condiciones de hipoxia solamente. Este aumento fue aún más pronunciado con el inserto de dos milímetros. La concentración de células endoteliales chapadas en insertos de dos milímetros se tituló a 25, 000, 50, 000 y 100, 000 células por inserto, respectivamente.
se encontró que el aumento de la intensidad de las células endoteliales en el cocultivo condujo a una atenuación dependiente de la dosis de la liberación de LDH causada por la FC. Sin embargo, no se observó tal efecto en condiciones normóxicas. Esta metodología de cocultivo no se limita a las células endoteliales y los cardiomiocitos. Estos métodos deberían ayudar a una investigación de interacciones célula-célula específicas entre líneas celulares variadas a través de múltiples órganos de interés.
