我々の知見は、内皮細胞心筋細胞共培養空間環境を最適化することが、模擬虚血再増殖傷害に対する心筋細胞保護における内皮細胞の役割を試験するための好ましいin vitroモデルを提供するために必要であることを示唆している。細胞共培養モデルは、細胞機能および分化に対する細胞間相互作用の役割を調査するために広く使用されてきた。しかしながら、細胞型間の別々の処理および単一細胞型の下流分析は、混合共培養において容易には実現不可能である。
現在の研究は、低酸素症の冒涜傷害を誘発し、その結果と単一の細胞型への影響を研究することができる、それらの間に意味のある距離を持つ2つの別々の細胞層を作成することを目的としていました。両方の細胞株を解凍することによって調製を開始する。細胞を新鮮な培地で洗浄した後、T25フラスコに細胞をプレートする。
翌日、細胞を培地でリフレッシュし、コンフルエントなときに使用します。細胞培養インキュベーターを摂氏37度に維持し、酸素21%、二酸化炭素5%、窒素74%を投与します。加湿してください。
光学顕微鏡下で心筋細胞株コンフルエントを推定する。コンフルエントな細胞培養物を含むフラスコから培地を取り出し、フラスコあたり3〜5ミリリットルのトリプシン-EDTAでトリプシン処理する。フラスコを静かに攪拌し、摂氏37度で2〜5分間インキュベートする。
その後、光学顕微鏡下で酵素進行度を評価する。剥離後、T25フラスコ当たり10ミリリットルの培地を含む50ミリリットルのチューブにトリシンまたは細胞溶液を加えてトリプシン溶液を不活性化する。細胞懸濁液を120 x gで2分間遠心分離し、軟細胞ペレットを得た。
遠心分離後、上清を除去し、ペレットを5ミリリットルの培地に再懸濁する。次に、細胞計数を行い、細胞生存率を確認する。10マイクロリットルの再懸濁細胞と10マイクロリットルのトリパンブルー色素を混合してアリコートし、次いで、細胞カウンターを用いて生細胞を計数する。
所望の播種密度を達成するために、新鮮な規則的な培地で細胞を希釈する。24ウェルプレートを取り、細胞外マトリックスおよびプレート心筋細胞で予めコーティングし、プレートの底部に1ウェルあたり300,000の播種密度でコーティングする。細胞を摂氏37度に維持し、一晩で5%の二酸化炭素を投与する。
24時間後、内皮細胞をインサート当たり100,000の最適なプレーティング密度でインサートにプレートする。内皮細胞プレーティングの24時間後、内皮細胞インサートを心筋細胞ウェル内に置き、共培養を開始する。実験を行う前に、細胞を12〜24時間共培養させる。
50ミリリットルの円錐管に約25ミリリットルの媒体を注ぐことによって、低酸素媒体を準備する。上部をシリコーン膜でエアシールし、滅菌ピペットを使用して穴を開けます。その後、別の穴を作り、ピペットの約2/3をメディアに沈めたままにします。
培地を毎分30リットルの流速で5分間低酸素ガスで洗い流し、その後、付着した細胞を含む24ウェルプレートまたは培養インサートの培地を捨てる。1ウェルあたり10%PBSの100マイクロリットルでそれらを非常に穏やかに洗浄し、新しく調製した低酸素培地をプレートまたはインサートの各ウェルに500マイクロリットル加える。正常酸素対照群のグルコースおよび血清を含む新鮮な正常培地で元の培地を交換する。
滅菌水で満たされたペトリ皿を低酸素チャンバーに入れ、チャンバーを加湿する。次に、低酸素基を含むプレートをチャンバーに入れます。低酸素チャンバーを低酸素ガスで毎分30リットルの流れで5分間洗い流す。
その後、チャンバーを摂氏37度のインキュベーター内に24時間置きます。低酸素状態の後、プレートまたはインサートの古い培地を捨て、グルコースおよび血清を含む500マイクロリットルの正常培地をプレートの各壁に加え、次いでプレートを通常の培養条件下でインキュベーター内に2時間保管して再灌流を模倣する。細胞培養培地を24ウェルプレートから96ウェルプレートに移し、次いで24ウェルプレートの各ウェルから200マイクロリットルの培地を採取し、96ウェルプレートの4ウェルに均等に分配した。
96ウェルプレートで細胞傷害性アッセイキットを使用してLDHの吸光度を測定し、製造業者の指示に従って細胞傷害の程度を決定した。この研究では、3種類のインサートが評価された。3つのインサートはすべて、0.4マイクロメートルの同じ孔径を有していた。
それらの間の唯一の違いは、2つの共培養細胞層間の距離を0.5、1.0、および2.0ミリメートルにすることができた、インサートからベースの高さまでであった。このプロトコールを用いて、細胞を通常の酸素条件下で培養し、次いで、正常酸素対照群および低酸素群の2つの群に分割した。24時間後、両群を培地でリフレッシュし、エンドポイントアッセイを実施する前に、通常の酸素条件下でさらに2時間培養した。
心筋細胞単独、内皮細胞単独、および心筋細胞と内皮細胞との共培養について乳酸脱水素酵素放出を評価する際の3種類の培養インサートの比較を、正常酸素、低酸素のみ、および低酸素再酸素化条件下で示す。細胞層間の距離が0.5ミリメートルの場合、低酸素症は心筋細胞を単独で培養した場合の正常酸素症と比較してLDH放出を有意に増加させた。しかしながら、LDHは、低酸素のみの群と比較して低酸素再酸素化群においてわずかに増加したのみであった。
内皮細胞と心筋細胞を共培養した場合、低酸素のみの条件下でのLDH放出の増加は減弱しなかった。このことは、内皮細胞が低酸素のみの条件下での心筋細胞単独群と比較して何ら保護効果を有していなかったことを示している。しかし、内皮細胞はHR中に心筋細胞に対して軽度だが有意な保護を発揮した。細胞層間の距離が1ミリメートルであったとき、LDH放出は、低酸素のみの条件下でのみ心筋細胞においても有意に増加した。
しかしながら、0.5ミリメートルインサートとは異なり、心筋細胞におけるLDH増加のみは、低酸素のみの条件に対するHRによって増強された。この増加は、2ミリメートルのインサートでさらに顕著であった。2ミリメートルのインサートに播種した内皮細胞の濃度を、インサート当たりそれぞれ25,000,50,000および100,000細胞に滴定した。
共培養における内皮細胞強度の増加は、HRによって引き起こされるLDH放出の用量依存的な減衰をもたらしたことが判明した。しかし、正常酸素条件下ではそのような効果は見られなかった。この共培養方法論は、内皮細胞および心筋細胞に限定されない。これらの方法は、関心のある複数の器官にわたる様々な細胞株間の特定の細胞間相互作用の調査に役立つはずである。
