Desenvolvemos um método simples sem Langendorff para isolar células cardíacas individuais do rato por uma técnica de embalagem antegrada. Este método permite o isolamento de células cardíacas de camundongos juvenis para mais velhos. A perfusão retrógrada baseada em Langendorff tem sido considerada um padrão-ouro para isolar miócitos cardíacos em vários animais experimentais.
No entanto, a canulação da LTA é tecnicamente difícil em camundongos devido ao seu pequeno tamanho. Para a colheita do coração do rato, depois de confirmar a eutanásia e raspar o abdômen, abra rapidamente a cavidade torácica para expor o coração e use uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada aproximadamente do tamanho do coração para sugar o coração para dentro da pipeta. Levante a pipeta para criar espaço suficiente para inserir tesouras curvas e use a tesoura para retirar o coração do lado dorsal tomando cuidado para evitar danificar o atria.
Imediatamente, coloque o coração em um copo de vidro de 30 mililitros contendo CIB-EGTA gelado por cerca de um minuto. Quando as contrações pararem, coloque o coração em um prato de cultura de 35 mililitros contendo CIB-EGTA gelado, e remova o pulmão e outros tecidos visíveis. Coloque o coração aproximadamente limpo em um suporte de coração cheio de lado do ápice CIB-EGTA refrigerado para baixo e coloque o suporte sob um microscópio estereoscópico.
Remova a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da aorta. Se o comprimento da aorta cortada for muito longo, corte a aorta logo abaixo da artéria braquiocefálica e oriente o coração para que a superfície anterior esteja voltada para a frente. Use pinças para levantar a extremidade da aorta e use um pequeno grampo vascular para fixar a aorta perto da ária enquanto empurra suavemente para baixo na ária.
Em seguida, coloque o coração preso em uma placa de perfusão com o lado anterior voltado para cima e hidrate o coração com algumas gotas de CIB-EGTA. Para a perfusão antegrada, carregue uma seringa de 20 mililitros contendo CIB-EGTA pré-armado conectado a um tubo de extensão flexível e uma agulha de injeção marcada na bomba de infusão e inicie a bomba a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitro por minuto. Quando a agulha e a bomba tiverem sido preenchidas, coloque a agulha de injeção na placa de perfusão com o lado mais curto da forma diagonal na frente e deslize a agulha até que ela esteja apenas tocando o ápice do coração.
Insira cuidadosamente a agulha perto do ápice do ventrículo esquerdo na câmara ventricular sem torcer ou soltar a agulha da placa, observando a marca para estimar a profundidade da inserção da agulha. Quando a inserção da agulha estiver completa, o sangue deve começar a fluir da artéria coronária. Use fita para fixar a agulha de injeção na placa e aumente a velocidade da bomba para um mililitro por minuto.
Se o coração for perfundido com sucesso, o fluxo do tampão no capilar deve ser visível logo abaixo do epicárdio. Após dois a três mililitros de perfusão CIB-EGTA, substitua o tampão de perfusão por mistura de enzimas. Depois de um a dois mililitros terem sido perfundidos, aumente a velocidade da bomba para 1,5 mililitros por minuto.
Use uma pipeta para remover o perfusato acumulado contendo sangue que flui do coração conforme necessário e parar a perfusão quando o volume total de enzima perfusada atingir 10 mililitros. No final da perfusão, transfira 10 mililitros de mistura de enzimas da seringa para um prato de cultura de 60 milímetros em um tapete de aquecimento e adicione 20 miligramas de BSA ao prato. Gire suavemente o prato para dissolver o pó e remover a agulha de injeção e fixar do coração.
Remova os ventrículos e atria do coração e coloque os tecidos na mistura de enzimas complementadas pela BSA. Para isolar os miócitos ventriculares, use dois pares de pinças para agarrar o epicárdio e puxar suavemente os ventrículos em pequenos pedaços. Quando todos os fragmentos do ventrículo tiverem sido gerados, disperse as células aproximadamente 30 vezes com tubulações suaves e filtre os detritos não digeridos através de um filtro de células de malha de 100 mícrons em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Após a centrifugação, resuspenha a pelota de cardiomioceto em CIB pré-armado complementado com cálcio e BSA e incubar as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, centrifugar as células novamente e resuspensar os cardiomiócitos precipitados em um volume apropriado de solução de resuspensão celular para sua manutenção a 37 graus Celsius até a análise a jusante. Para isolar os miócitos atrial, transfira a atria para um recipiente de CIB pré-armado complementado com cálcio e BSA e rasgue a ária em pedaços como demonstrado.
Use uma pipeta de 20 microliteres definida para 10 microliters para interromper os tecidos por pipetação e coletar as células dissociadas por centrifugação. Em seguida, resuspende a célula atrial em um volume apropriado de solução de ressuspensão celular. Nesta imagem, podem ser observados miócitos ventriculares recém-isolados.
Este procedimento de isolamento resulta em um rendimento de 70 a 80% de miócitos ventriculares quiescentes em forma de vara de oito a 10 semanas de idade em cerca de cinco horas de isolamento. A proporção de células viáveis recém-isoladas é menor em camundongos maiores de dois anos de idade. Os potenciais de ação registrados nos miócitos ventriculares e atrial são semelhantes aos medidos em células obtidas pelo método baseado em Langendorff.
A análise imunossulínica pode ser usada para avaliar a organização da estrutura sarcomerica dos miócitos ventriculares e a transformação dos fibroblastos cardíacos em miofibroblasts após a subcultura. Recomenda-se a análise de manchas ocidentais para determinar a expressão específica de proteínas de interesse nos átrios e ventrículos após o processamento. Após a perfusão com enzimas, as proteínas dos atria e ventrículos podem ser facilmente homogeneizadas no tampão de lise com força leve para extração de proteínas.
É importante controlar a direção e as profundidades da inserção da agulha. Ao inserir a agulha no ventrículo esquerdo, tome cuidado para não perfurar o septo ventricular ou penetrar na válvula. Você pode alterar a composição do perfusato dependendo do propósito do experimento.
Por exemplo, um detergente suplementado EGTA pode ser usado para fazer um andaime livre de células do coração.
