Este projecto foi financiado pelo Programa de UCSF para Breakthrough Biomedical Research (financiado em parte pela Fundação Sandler), o NIH Pathway to Prêmio Independência (R00HL114738), e da Fundação Edward Mallinckrodt Jr.. JJ foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do NIH (T32HL007731). Os autores são os únicos responsáveis ​​pelo conteúdo deste trabalho, o que não representa necessariamente a posição oficial do NIH.

Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo uso e cuidados Comitê Institucional Animal da Universidade da Califórnia, em San Francisco. NOTA: Resumidamente, após extrair o coração do tórax rato, perfusão retrógrada coronariana é usado para digerir de forma eficiente a matriz extracelular com colagenase e XIV protease. Os ventrículos são, em seguida, isolado, dissociadas mecanicamente e filtrada para uma suspensão de células única. sedimentação por gravidade é realizada para isolar cardiomiócitos, que são separados a partir de células do estroma, como fibroblastos e as células endoteliais pela sua elevada densidade. Os cardiomiócitos purificadas podem ser cultivadas durante semanas a poliestireno revestidas com laminina e transduzidas com vectores de genes de adenovírus. Isolamento 1. Cardiomyocyte <ol><li> Prepare tampões, Estação cirúrgico e aparelho de perfusão <ol><li> Prepare tampões e meios de comunicação de acordo com a Table 1. </li><li> Ligue banho de água circulante, ajustar a temperatura de entrada de modo que a saída da camisa de água aquecida a uma temperatura de 37 ° C. </li><li> sistema de perfusão limpo por lavagem com etanol 70%. Em seguida, remover todos os vestígios de etanol a partir do sistema, através de lavagem com vários volumes de água estéril. </li><li> Carregar o sistema de perfusão com tampão de perfusão (Tabela 1). Em primeiro lugar a água de drenagem do sistema, em seguida, lavar com 2 volumes de tampão de perfusão. Em seguida, encher o espaço morto com tampão de perfusão de modo que a coluna interna do revestimento de calor é cheia com tampão de perfusão, mas a câmara de debubbling está vazia. DICA: Garantir que não haja bolhas de ar estão presentes na linha de baixo da câmara de debubbling. Para remover as bolhas recalcitrantes, envolver todas as torneiras e permitir que a pressão para construir dentro da linha por alguns segundos. Em seguida, solte a torneira inferior, permitindo que o tampão de perfusão de alta pressão para jato da tomada; o fluxo rápido e turbulence vai ajudar a desalojar bolhas que são capturados perto da saída de perfusão. </li><li> Prepara-se uma seringa com a agulha para ser utilizada para o uso da aorta. Anexar uma agulha romba de 18 L a uma seringa de 1 mL cheio com tampão de perfusão. Remova as bolhas de ar e fixar o conjunto da seringa para um braço do iluminador de dissecação miscroscope com fita laboratório. DICA: Para criar uma pipeta sem corte de uma agulha chanfrada, transecto o eixo da agulha com cortadores de fio. Então afiar a ponta com uma pedra de lixar até que a ponta é plana. NOTA: Para reduzir o deslizamento da aorta a partir da agulha durante a canulação, encrespar o eixo da agulha de punção usando uma lâmina de barbear. Fixar a agulha pelo cubo e do eixo superior, em seguida, via a lâmina e para trás perpendicularmente ao eixo longo do eixo da agulha durante a rotação até várias ranhuras ter sido criado dentro de 1 cm da ponta da haste de agulha. Mudar para um novo aparelho de barbear quando a lâmina torna-se maçante. </li><li> Coloque um pano limpoprato de petri abaixo do microscópio de dissecação para conter o coração durante a canulação. Posicionar o braço iluminador de tal modo que a ponta da cânula é perto da borda do campo de visão, mas não obstruindo a dissecção. Assegurar a ponta da cânula é abaixo da borda da placa de Petri. NOTA: Para ajudar a imobilizar o coração durante a dissecção, coloque uma pequena (~ 5-7 cm2) quadrada de 215 mesh micron na placa de Petri. Quando o coração é colocada sobre esta malha, que vai criar fricção para reduzir o deslizamento e rotação do coração durante a manipulação mecânica. </li><li> Laço 2 suturas soltas com nós overhand duplas em torno do cubo da cânula da agulha a ser utilizados para a fixação da aorta. </li></ol></li><li> Extracção do coração e canulação <ol><li> Administrar heparina (5 UI / g de peso corporal) por meio de injecção intraperitoneal. Esperar 20 min para permitir que a heparina para fazer circular para o coração. </li><li> Anestesiar o rato por injeção intraperitonealião de carbamato de etilo de 20% (2 mg de carbamato de etilo / g de peso corporal). Observar de perto até que o mouse está sob anestesia profunda (aproximadamente 3-5 minutos). NOTA: anestesia profunda é confirmado pela falta de ambos pitada dedo do pé e dos reflexos da córnea. Se o rato não atingiu anestesia profunda por 8-10 min, em seguida, administrar uma dose adicional de carbamato de etilo. Embora as respostas individuais à anestesia irá variar entre ratos, falha para entrar anestesia profunda após a primeira dose pode indicar carbamato de etila degradada, o que pode impedir a anestesia profunda, mesmo após a administração repetida. Para evitar a degradação, prepare uma solução fresca de carbamato de etila antes de cada utilização. </li><li> Imobilizar o mouse para a plataforma de cirurgia, assegurando cada membro com fita cirúrgica. Desinfectar a área da incisão com uma quantidade generosa de 70% de etanol. Seque com um laboratório-wipe. </li><li> Levante a pele com uma pinça, logo abaixo do esterno. Faça uma incisão lateral com uma tesoura pequena, corte through a pele e abdômen. </li><li> Use hemostats para levantar delicadamente a caixa torácica através do esterno. Usando pequenas tesouras de dissecação, alargar a incisão em forma de V para o axilas. Corte através da primeira costela e perfurar o diafragma em cada lado. </li><li> Continue a levantar a caixa torácica com hemostats e usar uma tesoura pequena Iris para transecto completamente o diafragma. Tome cuidado para não perfurar o coração. </li><li> Retrair a caixa torácica rostralmente usando hemostats anexados e rapidamente, mas estenda cuidadosamente a incisão em forma de V, cortando através da caixa torácica em direção à axila em ambos os lados. Retrair a parte do meio da caixa torácica total e estabelecer as hemostats ligados para manter no lugar. </li><li> Remover o pericárdio usando uma pinça fina. </li><li> Enquanto suavemente levantar o coração usando uma pinça curva, transecto as veias e artérias ligadas ao coração. Colocar imediatamente o coração em tampão de perfusão gelada para retardar a contração muscular. </li><li> Colocar o coração num prato de petri sobum microscópio de dissecção (local em um pequeno pedaço de 215 mm de malha para ajudar a imobilizar durante a dissecção). Apare qualquer tecido não cardíaca excesso usando finas íris tesoura. Tenha cuidado ao cortar perto da aorta. </li><li> Transecto da aorta perto da artéria brachioencephalic, e tomar cuidado para não deixar bolhas ou restos de tecido entrar na abertura. </li><li> Encher a placa de petri contendo o coração com tampão de perfusão de gelo frio de tal modo que o nível do líquido sobe acima da abertura da cânula. A bainha da aorta para a cânula de tal modo que a ponta é imediatamente distai à válvula aórtica. NOTA: Para reduzir o risco de embolia gasosa, comprimir ligeiramente a seringa sobre a cânula antes da canulação, a fim de remover as bolhas de ar possíveis que podem ter desenvolvido no final da cânula. Para além disso, manter a ponta da cânula da aorta e sob a superfície da solução para evitar a introdução de bolhas enquanto embainhar a aorta. </li><li> Deslize um pré-amarrado 7-0 sutura de seda para baixoo eixo da agulha de punção e a posição imediatamente acima da ponta da agulha. Apertar o nó com uma pinça fina. Repita este passo com a segunda sutura colocado logo acima do primeiro. NOTA: Verifique se a ponta da agulha está ainda acima da válvula aórtica antes e depois de apertar. </li><li> Lentamente deprimir a seringa para ejectar 0,5 ml de tampão de perfusão através da vasculatura coronária. NOTA: Se a punção foi bem-sucedida, o sangue vai ser visualizado deixando a vasculatura coronária e pooling fora das veias dorsais e artérias. IMPORTANTE: O tempo de abertura da cavidade torácica (em particular, a perfuração do diafragma) para perfusão inicial deve ser minimizada para reduzir a exposição hipóxica e maximizar a sobrevivência e a saúde dos cardiomiócitos isolados. Idealmente, este tempo deve ser inferior a 5 min. </li></ol></li><li> perfusão NOTA: A perfusão retrógradaaparelho pode ser convenientemente operado em um ambiente limpo em um banco de laboratório padrão ou colocado em uma capela de fluxo laminar para maximizar a esterilidade. No entanto, após a perfusão é completa, os trabalhos devem ser realizados sob fluxo laminar, para minimizar a contaminação. <ol><li> Gentil mas firmemente remover o hub cânula da seringa (usando luvas estéreis) lentamente torcendo e para trás. Ao puxar a agulha de punção para fora da seringa, lentamente ejectar tampão de perfusão dentro do cubo da agulha, a fim de evitar que as bolhas de ar durante a perfusão. </li><li> Retire o tubo de recirculação de captura de baixo da porta de saída de perfusão e substituir com uma taça de captura de resíduos. Anexar o hub agulha para o adaptador luer que é fixo para a porta de saída de perfusão (Figuras 1, 2) na camisa de água, enquanto a bomba estiver em execução no nível mais baixo (15 RPM, ~ 6 ml / min). DICA: Ao conectar o centro da agulha ao adaptador luer, permitir que o tampão de perfusão pingando para connecte para o líquido no centro da agulha, a fim de evitar a introdução de bolhas. </li><li> Perfundir o coração sem recirculação até 8 ml de tampão de perfusão foram aspirados pelo tubo de carga. NOTA: O volume de tampão de perfusão aspirado pela mangueira de entrada neste passo assume um volume morto de 7 ml para o sistema de perfusão, dando um total de 15 ml de tampão de perfusão bombeado através do coração. </li><li> Remover o tubo de entrada a partir do tampão de perfusão. Permitir ar a ser aspirado pela entrada para menos do que o volume morto do sistema. NOTA: O volume de ar aspirado neste passo deve ser ajustado para evitar que o ar entre na vasculatura coronária (ver o passo 1.3.7). </li><li> Colocar o tubo de entrada para o tampão de digestão (Tabela 1), um pouco acima do fundo do tubo. Alimentação lentamente e permitir que o tubo de entrada para aspirar um volume suficiente para evitar o enchimento excessivo do tubo. </li><li> Visualizar e acompanhar a bolhas de ar entreo tampão de perfusão e o tampão de digestão à medida que viaja através da camisa de calor. Observar o nível de tampão de perfusão no centro do revestimento de calor começará a cair uma vez que a bolha de ar chega à câmara de borbulhagem de. Uma vez que o tampão de digestão atinge a câmara-de borbulhar, o nível do líquido no revestimento de calor permanecerá estável. IMPORTANTE: Se o nível de tampão de perfusão cai muito baixo, feche a torneira de saída e abra a torneira de ventilação. Permitir que o nível a subir para um nível confortável (3 - 5 polegadas acima do orifício de saída). Em seguida, parar a bomba de perfusão e fechar a torneira ventilação. Abrir a torneira porta de saída e reiniciar a bomba de perfusão. </li><li> Assista a solução que emerge do coração. Como o último do tampão de perfusão deixa o coração e o tampão de digestão começa a circular através do coração, mudança de cor de transparente para castanho claro irá ser observado devido à presença de colagenase. </li><li> Perfundir o coração com tampão de digestãopara cerca de 10 - 15 min. O coração começará slouching como o colágeno é degradado e perde suporte mecânico. </li></ol></li><li> A dissociação mecânica e Purificação <ol><li> Retire o coração da cânula com uma pinça e coloque em um prato de petri seco. cortar rapidamente tecido extra-ventricular usando finas íris tesoura. Transfira os ventrículos para um prato contendo tampão de perfusão petri fresca para lavar. Mova a placa de Petri com um capuz estéril e transferir os ventrículos, um prato fresco petri seco. </li><li> Recolha 7,5 ml de tampão de digestão da jaqueta de fogo e adicione 2,8 mL de 1 M CaCl 2, misturar por inversão. Adicionar 2 - 3 ml de tampão de digestão com CaCl2 para os ventrículos na placa de Petri. NOTA: A concentração de Ca2 + é gerado a partir de 300 a 700 ^ M </li><li> Tritura-se rapidamente o tecido ventricular com uma pinça fina, de modo que a maioria das peças é menor do que 1 mm 3. Adicione o restanteing tampão de digestão Ca 2+ complementada a partir do passo 1.3.2 para os ventrículos dissociados na placa de Petri e misturar por agitação suave. </li><li> Colocar a placa de petri em 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Agitar a placa de Petri cada 2 minutos até cardiomiócitos suficientes (ver nota abaixo) foram liberados a partir do tecido. NOTA: A duração da incubação pode ter de ser ajustada para ajustar o grau de digestão de acordo com as necessidades da experiência. Geralmente, tempos de incubação mais longos, aumentam o rendimento e pureza, mas pode reduzir a taxa de ligação e sobrevivência celular. 5 - 10 minutos é geralmente suficiente para se conseguir um rendimento elevado (~ 5 - 10 x 10 5 células por coração). </li><li> Transferir a placa de petri de volta para uma câmara de fluxo laminar. Usando uma pipeta de transferência cortada num ângulo de 45 °, gentilmente pipeta o tecido a dissociar-se ainda mais. </li><li> Use luvas estéreis para dobrar a malha de 215 mm em um cone e mantenha durante um cônico de 50 ml. Pipetaa suspensão de tecido dissociado sobre a rede e permitir que o filtrado para se escoar para os 50 ml cónico. Utilizar 7,5 mL de tampão de paragem pré-aquecido (Tabela 1) para lavar os cardiomiócitos a partir da placa de Petri através da malha, que combina com o primeiro filtrado. NOTA: Ca2 + é elevado para um volume final de 1,1 mM e FBS a final, 2,5% no tampão de paragem neutraliza a actividade de protease. </li><li> Transferir a suspensão de células para uma cónico de 15 ml e deixa-se repousar por gravidade durante 15 minutos. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante com uma pipeta de transferência de tal modo que apenas 50 - 100 ul de solução permanece acima das células. Adicionar 10 ml de pré-aquecido, meios de cultura equilibrada (Tabela 1) e misturar por inversão suave. Permitir que os cardiomiócitos para resolver pela força da gravidade para 15 min. DICA: Para aumentar a pureza, repita o passo 1.4.8 se o desejar. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de transferência de modo que apenas 50 - 100 ul oF solução permanece acima das células. </li></ol></li></ol> 2. Cultura cardiomiócitos <ol><li> Pré-revestimento de cultura de tecidos tratado com placas de petri com laminina (10 ug / ml) e armazenar a 37 ° C durante 2 h antes de plaqueamento de células. Imediatamente antes do plaqueamento, aspirar a solução de laminina a partir da placa de cultura de tecidos. Lavar uma vez com MEM ou PBS, em seguida, aspirar o líquido residual para remover laminina não adsorvida. </li><li> Adicionar o suficiente pré-aquecido, meios de cultura equilibrada para alcançar densidade celular desejado, misturar por inversão suave. Placa desejada concentração de células no recipiente de cultura (tipicamente 5 - 20 x 10 4 células / cm2). Para avaliar o rendimento de isolamento de cardiomiócitos, contagem de células através de hemocitómetro ou teste da placa através da verificação da densidade ao microscópio. Um coração de ratinho adulto proporciona tipicamente 0,5 - 1,0 x 10 6 células, nesta fase do protocolo. DICA: Se estiver usando placas de 96 poços, use uma micropip 1.000 ulette com uma ponta de corte com um ângulo de 45 ° para minimizar os danos celulares, devido à força de cisalhamento. Colocar a ponta da pipeta de modo a que estiver em contacto com o fundo do poço, durante a ejecção de suspensão de células a fim de minimizar a introdução de bolhas. </li><li> Mover o prato de cultura de células prontamente para uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade. Mudança de mídia conforme necessário para evitar a acidificação: a cada 1 - 5 dias, dependendo da densidade celular. Minimizar manuseamento da placa de cultura durante as primeiras 3 - 6 dias para facilitar a fixação à superfície de cultura de células. NOTA: Para minimizar a perturbação celular durante alterações na mídia quando as células ainda não estão totalmente ligados, execute uma mudança de meia-media. Lentamente, aspirar a mídia, mantendo a ponta da pipeta logo abaixo da superfície da mídia. Em seguida, adicionar lentamente meios adicional, mantendo a ponta da pipeta apenas acima da superfície dos meios contra a parede da placa de cultura. </li><li> Para avaliar a viabilidade de cardiomiócitos, verifiquea morfologia sob microscopia de campo claro. Recém cardiomiócitos isolados manter uma morfologia mais ou menos em forma de haste com bordas afiadas, distintas sob iluminação de campo claro (Figura 2). NOTA: Confirme viabilidade por coloração das células com azul de tripano. </li><li> Para avaliar a pureza do isolamento dos cardiomiócitos, verifique a morfologia celular para identificar cardiomiócitos. Manchar os núcleos com Hoescht 33342 para identificar células totais. NOTA: Os cardiomiócitos podem ser identificados a partir de não-cardiomiócitos pela sua morfologia característica (rod-shaped) e tamanho (cerca de 100-200 mm de comprimento). Alternativamente, recentemente isolados cardiomiócitos vai manchar positivo para marcadores específicos de cardiomiócitos, como a alfa-actinina 26 (Figura 3C, D) ou troponina T. 27 </li></ol> 3. Transdução Gene com Adenovírus <ol><li> Prepare lisado celular utilizando adenovírus m estabelecidaétodos. 21 transduzir os cardiomiócitos usando ligado de células a partir de células produtoras de adenovirus 10. No dia 0 ou dia 1 após o isolamento, adicione cuidadosamente o ligado celular para a mídia que contém os cardiomiócitos. NOTA: A preparação de adenovírus título elevado irá atingir forte expressão em cerca de 48-72 h. Ajuste a multiplicidade de infecção de acordo com o delineamento experimental. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A saúde geral dos cardiomiócitos isolados depende de vários aspectos importantes deste protocolo. Em primeiro lugar, o tempo de extracção coração a perfusão é crítica e deve ser realizado em 5 minutos ou menos. A remoção do cálcio ajuda a dissociar as interacções célula-célula, mas podem ter um impacto negativo a saúde das células a longo prazo. 29-32 Assim, considera-se suficiente para remover o cálcio durante os primeiros poucos minutos de perfusão de EGTA (ácido tetracético de etilen...

Cardiomiócitos cultivados são frequentemente usados ​​para monitorar o comportamento das células em um ambiente bem controlado in vitro. Por exemplo, as propriedades morfológicas celulares, eléctricos, bioquímicos, ou mecânicas pode ser estudada em substratos modificados, 1,2 em meio definido, e em resposta a fármacos de moléculas pequenas, péptidos, de regulação génica, 3 ou estimulação eléctrica. 4 O conteúdo celular pode também ser controlado usando co-culturas definidas. 5 Estas experiências in vitro são úteis em grande droga ou telas genéticos e complementar métodos in vivo para vários tipos de investigações envolvendo a biologia dos cardiomiócitos. cultura de longo prazo permite avenidas experimentais que requerem períodos de tempo prolongados para alcançar a mudança fenotípica. Um exemplo oportuno é o da proliferação de cardiomiócitos de mamíferos adultos, onde desdiferenciação, ciclo celular re-entrada, e a divisão celular é normalmente estudado ao longo SEdias veral a semanas. 6,7 Aqui, o tempo de cultura estendido facilita a manipulação genética, 7,8 desdiferenciação funcional (por exemplo, a desmontagem sarcomérica) 9 e desdiferenciação potencialmente transcrição. 6 subsequente ciclo celular re-entrada e de divisão celular requer períodos de cultura ainda mais longos para observar, especialmente se vários ciclos de divisão são o objetivo experimental. A importância do ciclo celular cardiomiócitos é central para diversos trabalhos científicos recentes chave na regeneração do coração, onde o desdiferenciação e proliferação de cardiomiócitos pré-existentes tem sido mostrado responsável para a regeneração cardíaca no peixe-zebra e ratinhos neonatais. 10-12 Assim, a possibilidade para estimular a desdiferenciação do ciclo celular e re-entrada no cardiomiócitos adultos mamíferos continua a ser uma questão-chave na regeneração coração humano 13-15 Experimentos in vitro estudando o ciclo celular de cardio mamíferos I nmiócitos foram predominantemente utilizadas fontes de rato, devido à sua relativa facilidade de cultura a longo prazo em comparação com os modelos de ratinho. 16 No entanto, os sistemas de murideo oferecer uma rica fonte de ferramentas transgénicos bem caracterizados e modelos de doenças que são úteis em estudos in vitro e in vivo protocolos. Por exemplo, o rastreamento de linhagem baseada em Cre permitiu a identificação de cardiomiócitos pré-existentes como fonte de regeneração do miocárdio no coração neonatal do rato in vivo. 12 estudos in vitro de cardiomiócitos de rato neonatal traçado da linhagem permitiram a análise de interações com estromal células através de co-cultura com fibroblastos. 5 no entanto, devido aos seus desafios, 17 existem poucos relatos de cultura e isolamento de longo prazo de cardiomiócitos de rato adulto 18,19. O isolamento dos cardiomiócitos viáveis ​​de ratinho adulto para a cultura a curto prazo só é conhecido por ser uma tarefa difícil. este PROTOCol fornece instruções passo-a-passo sobre como conseguir cardiomiócitos viáveis ​​de ratos adultos que podem ser usados ​​tanto para curto prazo, bem como investigações de longo prazo. Cardiomiócitos isolados usando este protocolo pode ser eficientemente transduzidas com vetores adenovirais 20,21 e cultivadas durante semanas. Estes métodos proporcionam um sistema poderoso para estudar a biologia dos cardiomiócitos in vitro. Os métodos aqui descritos são baseados em vários elementos de obras anteriores usando variações da perfusão retrógrada Langendorff. 18,22 Apesar de vários protocolos foram publicados sobre o isolamento dos cardiomiócitos de rato adulto para a cultura de curto prazo e de estudo, a vantagem de 23-25 este protocolo é a capacidade de cultura do isolado cardiomiócitos longo prazo. Isso será útil no estudo de processos celulares que envolvem a expressão de genes ectópicos e que requerem períodos de tempo prolongados, tais como em estratégias de reprogramação celulares.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heated water jacket</td><td>Radnoti</td><td>158831</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water bath, Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pump</td><td>Watson-Marlow</td><td>323</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Exelta</td><td>63042-090</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 curved forceps</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Small dissection scissors</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Extra fine bonn scissors</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine spring scissors</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25837</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25414</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>86329</td><td></td></tr><tr><td>Butane dione monoxime (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP310100</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Novo Nordisk</td><td>393153</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-288</td><td></td></tr><tr><td>Protease, type XIV</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>JRS</td><td>43613</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>NC9141851</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Carbamate</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA44804-18</td><td></td></tr><tr><td>215 micron mesh</td><td>Component supply</td><td>U-CMN-215-A</td><td></td></tr><tr><td>20 G blunt ended needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305183</td><td></td></tr><tr><td>20 G beveled needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tape</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture, 7-0</td><td>Teleflex</td><td>15B051000</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha-actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes

Cardiomiócitos cultivados podem ser usadas para estudar a biologia dos cardiomiócitos utilizando técnicas que são complementares a sistemas in vivo. Por exemplo, a pureza ea acessibilidade da cultura in vitro permite um controle fino sobre análises bioquímicas, imagens ao vivo e eletrofisiologia. cultura a longo prazo dos cardiomiócitos oferece acesso a abordagens experimentais adicionais que não podem ser concluídos em culturas de curto prazo. Por exemplo, a investigação in vitro de desdiferenciação, do ciclo celular de re-entrada e divisão de células tem, até agora, em grande parte sido restrita a cardiomiócitos de rato, que parecem ser mais robusta em cultura a longo prazo. No entanto, a disponibilidade de um rico conjunto de ferramentas de linhagens de camundongos transgênicos e modelos de doenças bem desenvolvidos tornar os sistemas de rato atraente para a investigação cardíaca. Embora existam vários relatos de rato adulto isolamento dos cardiomiócitos, alguns estudos demonstram sua cultura a longo prazo. Apresentado aqui, é um método passo-a-passo para oisolamento e longo prazo cultura de cardiomiócitos adultos do mouse. Em primeiro lugar, a perfusão de Langendorff retrógrada é usado eficientemente para digerir o coração com proteases, seguido por purificação por gravidade sedimentação. Após um período de desdiferenciação após o isolamento, as células gradualmente anexar à cultura e podem ser cultivadas por semana. ligado celular de adenovírus é utilizado para transduzir eficientemente os cardiomiócitos isolados. Esses métodos fornecem um simples sistema de modelo, mas poderosa para estudar a biologia cardíaca.

Um tipo adulto selvagem ICR (CD1) do coração do rato normalmente produz 500.000 a 1 milhão de cardiomiócitos a partir de um isolamento bem sucedido. Imediatamente após o isolamento, as células principalmente manter uma aparência em forma de haste (Figura 3A) com sarcómeros e intactas podem ser utilizados para estudos funcionais que envolvem a contractilidade dos cardiomiócitos. Uma elevada percentagem dos cardiomiócitos em forma de haste (acima de 90%) é uma i...

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Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

isolation-culture-and-transduction-of-adult-mouse-cardiomyocytes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

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Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Medicina

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...