Esta técnica é mais confiável e eficiente e não requer prática extensiva ou treinamento em comparação com as técnicas de aparelhos de Langendorff mais comumente utilizadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela limita o tempo de isquemia desde que a perfusão inicial ocorra in vivo. Ao realizar essa técnica, é essencial evitar bolhas no coletor e evitar movimentos excessivos do coração durante a digestão, estas podem diminuir o rendimento.
Quem demonstrará essa técnica será Sarah Sturgill, aluna de pós-graduação no laboratório do Dr. Mark Ziolo. Comece limpando o coletor com temperatura controlada usando tampão de perfusão recém-preparado. Para isso, rosqueie em uma agulha calibre 27 e limpe as bolhas usando um conector luer lock.
Certifique-se de que não restam bolhas. Para isolar o cardiomiócito, expor o esterno do camundongo totalmente anestesiado e lateralmente à linha média, cortar proximalmente através das costelas e da axila. Em seguida, corte o diafragma, garantindo cortes rasos para evitar o coração.
Aperte o esterno com um hemostático e dobre as costelas para trás para expor a cavidade torácica. Remova o pericárdio do coração suavemente antes de cortar a veia cava inferior imediatamente distal ao coração. Injete três mililitros de tampão de limpeza gelada no ventrículo direito do coração durante um minuto usando uma agulha de calibre 27.
Em seguida, segure o coração usando uma pinça. Puxe-o para longe do corpo e exponha o máximo possível da aorta. Em seguida, pinça a aorta ascendente usando um hemostático e excise o coração.
Transfira rapidamente o coração pinçado para a tampa de uma placa de Petri de polipropileno contendo 10 mililitros de tampão de perfusão quente. Coloque o coração pinçado na plataforma de suporte e injete 10 mililitros de tampão de perfusão com temperatura controlada a 37 graus Celsius no ventrículo esquerdo durante cinco minutos usando uma agulha estabilizada de calibre 27 acoplada ao coletor. Em seguida, transfira o coração pinçado e a plataforma de suporte para uma placa de Petri com aproximadamente cinco mililitros de tampão de digestão.
Troque seringas de entrada por uma seringa de 50 mililitros contendo 25 mililitros de tampão de digestão. Limpe o coletor de quaisquer bolhas e o tampão de perfusão restante antes da injeção. Substitua cuidadosamente a agulha na mesma posição da agulha no ápice do ventrículo esquerdo.
Com a ajuda de uma bomba de perfusão, injete 37 graus Celsius tampão de digestão no ventrículo esquerdo por 15 minutos usando uma seringa de 50 mililitros. Controle a temperatura da solução com uma camisa de água calibrada para ejetar 37 graus Celsius da solução. Retire os ventrículos dos átrios antes de transferi-los para um copo de 10 mililitros.
Adicione três mililitros de tampão de digestão ao copo e corte os ventrículos em pedaços grandes usando uma tesoura afiada. Cubra o copo com papel alumínio e coloque-o em banho-maria pré-aquecido a 37 graus Celsius durante cinco minutos. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda os pedaços de tecido em três mililitros de tampão de digestão e triture-o por aproximadamente quatro minutos ou até que se obtenha uma mistura homogênea.
Uma vez feito, filtre as células em um tubo de polipropileno de 50 mililitros usando um filtro de células de nylon de 70 micrômetros. Lave o filtro de células de nylon com três mililitros de tampão de digestão. Devolva o filtrado a um tubo de polipropileno redondo de fundo de 14 mililitros e centrifugue-o.
Descarte o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em três mililitros de tampão de parada. À suspensão celular, adicione 54 microlitros de estoque de cloreto de cálcio 100 milimolares para tornar a concentração final de cloreto de cálcio de 1,8 milimolar. Deixe as células vivas se acomodarem por 10 minutos e remova o sobrenadante contendo células mortas.
Após ressuspender o pellet em uma solução de armazenamento, as células podem ser usadas para experimentos funcionais e culturas. Imagens de microscópio de campo claro de células isoladas mostraram que o isolamento de cardiomiócitos de camundongos produziu células quiescentes em forma de bastonete, sem bolhas de membrana ou bordas arredondadas. As células apresentaram rendimento aproximado de 80% e altas taxas de sobrevivência determinando o sucesso da técnica de isolamento.
Para um isolamento bem-sucedido, é mais importante remover as bolhas do coletor e inserir a agulha no mesmo orifício do coração. Uma vez isolados, os cardiomiócitos podem ser utilizados para experimentos funcionais celulares e moleculares.
