Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) e K23DC014517 (Johnson, PI) do Instituto Nacional de Surdez e outros Transtornos de Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde.

Este estudo foi realizado em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Nova York.
1. Disseca laringe de rato
<ol><li>Eutanize rato de acordo com o protocolo institucionalmente aprovado. Raspe o pescoço ventral da mandíbula para o manúbrio e cotonete com álcool para evitar a contaminação de peles nos espécimes teciduais.</li>
	<li>Sob um escopo de dissecação com 10x de ampliação, extirpar toda a laringe, criando uma incisão do pescoço médio com um bisturi até que a traqueia seja exposta.</li>
	<li>Separe os músculos laríngeos extrínsecos ventral na linha média para expor a laringe usando fórceps e dissecando tesouras ou um bisturi.</li>
	<li>Corte a traqueia caudal até o terceiro anel traqueal e faça uma rostral incisão ao osso hioide para extirpor toda a laringe usando tesoura dissecando.</li>
	<li>Remova os tecidos laríngeos extrínsecos (esôfago, glândula tireoide e músculos laríngeos extrínsecos) da laringe usando ferramentas de microdisseção (pinças, pinos e microscisores) sob ampliação.</li>
	<li>Com microscisores, bissecção a laringe dorsalmente entre os aritóides usando a linha média entre os músculos cricoarytenoides posteriores como um marco. Fixar paredes laterais da laringe para expor as dobras vocais e, em seguida, bissect ventrally através da linha média da cartilagem tireoide entre a comissura anterior das dobras vocais com microscisores (Figura 1). NOTA: Esta etapa pode ser opcional; ele pode ser pulado para manter a laringe inteira. A biseção de laringes permite múltiplas técnicas de imunossuagem usando separadamente os lados direito e esquerdo da mesma laringe.</li>
	<li>Enxágüe cada hemi-laringe em solução tamponada de fosfato (PBS) por ~10 s e seque delicadamente com um limpador de tarefas para reduzir a formação de cristais de gelo durante o congelamento.</li>
</ol>2. Fixar e/ou congelar o tecido laríngeo
NOTA: A fixação pode não ser ideal para todos os protocolos de imunossuagem. Muitas vezes os tecidos laríngeos são congelados imediatamente após a dissecção. Pule a etapa 2.1 para congelar o tecido laríngeo sem fixação.
<ol><li>Para fixar hemi-laringes coloque tecidos em tubo de centrífuga preenchido com 4% de formaldeído em PBS por 1 h à temperatura ambiente em um agitador orbital a 70 rpm. Transfira tecidos para um tubo de centrífuga limpo e enxágue 3x por 20 min em PBS. Em seguida, transfira para um tubo de centrífuga limpo e submerse em uma solução de 20% de sacarose/5% de glicerol (~18 h ou até que o tecido afunde) a 4 °C. ATENÇÃO: O formaldeído é perigoso e deve ser usado em um capô de fumaça, juntamente com equipamentos de proteção individual adequados.</li>
	<li>Coloque todas as hemi-larynges em uma posição uniforme em um molde crio-mold cheio com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Para um hemilarnox, coloque o tecido com a superfície medial da dobra vocal voltada para a parte inferior do criomold e o aspecto longitudinal da dobra vocal paralela à borda inferior da abertura criomold. Para laringes inteiros, coloque o tecido com os cricoarytenoides posteriores voltados para a parte inferior do criomold e o aspecto longitudinal da dobra vocal paralela à borda inferior da abertura criomold. NOTA: A orientação laríngea consistente dentro do composto OCT é fundamental para a crioseção da dobra vocal do rato. Uma vez que o hemilarynx esteja embutido e congelado, ele deve ser descongelado para mudar sua orientação, introduzindo assim riscos de danos teciduais de múltiplos ciclos de congelamento de degelo.</li>
	<li>Tecidos de congelamento de flash usando isopentano (2-metilbutano) refrigerados em um béquer de aço cercado por nitrogênio líquido. NOTA: A isopentane atinge a temperatura ideal para congelamento de tecidos quando precipitações brancas começam a se formar nas laterais e na parte inferior do béquer13. Isopientano é usado porque tem uma condutividade térmica maior do que o nitrogênio líquido, o que ajuda a evitar a quebra do bloco tecidual durante o congelamento rápido. Para obter uma descrição mais detalhada do tecido de congelamento em OTC consulte Kumar et al.13.</li>
	<li>Enrole cada molde em papel alumínio pré-rotulado e coloque em um saco de congelador individual para evitar a desidratação e armazene imediatamente em gelo seco até ser transferido para armazenamento em um congelador de -80 °C.</li>
</ol>3. Criosection hemilarynx em avião transversal
<ol><li>Ajuste a temperatura da câmara no criostato para -20 °C, que está no meio da faixa de temperatura (15-25 °C) recomendada para seção de tecido muscular pelo manual do fabricante.</li>
	<li>Defina a espessura da seção criostata para seções de 10 μm de espessura. NOTA: Para a análise transversal da fibra muscular, as seções de 10 μm de espessura são ideais para permitir a coloração completa e intensidade de imagem robusta das fibras musculares rotuladas para análise de digitação de fibras14,15,16. Alguns protocolos podem exigir espessura de seção diferente dependendo de alvos neuromusculares.</li>
	<li>Transfira tecidos para a câmara criostat, adicione uma camada uniforme de composto OCT no disco da amostra criostat (chuck) e coloque o bloco de tecido incorporado em cima do composto OCT no disco da amostra. Para obter seções transversais da dobra vocal para análise de fibra muscular tireonitoide (TA), afixe a amostra no mandril para que a cartilagem da tireoide ventral enfrente a lâmina criostat e a cartilagem aritóide enfrente o disco da amostra. NOTA: É fundamental notar que esses marcos não são visíveis nesta fase, devido ao composto OCT tornar-se branco e opaco quando congelado. Essa falta de visibilidade é a razão pela qual é fundamental notar a orientação do hemilarynx durante a fase de congelamento do flash.</li>
	<li>Corte o composto OCT avançando a cabeça da amostra em 100 μm até que a porção ventral da cartilagem da tireoide apareça.</li>
	<li>Em seguida, aparar e acompanhar seções de 30 μm desde o início da cartilagem tireoide até que a lavíria propria, os músculos M medial e o músculo TA lateral sejam expostos. NOTA: Os marcos laríngeos devem ser rastreados e observados desde o início da cartilagem da tireoide a cada 100 μm para garantir que o ângulo de secção não seja oblíquo. A Figura 2 representa os dois conjuntos de marcos laríngeos no plano transversal a 10x de ampliação.</li>
	<li>Uma vez alcançado o músculo TA alvo, colete seções em slides carregados positivamente a 10 μm.</li>
	<li>Armazene seções em PBS a 4 °C para reter a umidade até que estejam prontas para serem manchadas. NOTA: O tecido fixo pode ser armazenado em PBS até uma semana, dependendo do alvo IHC, enquanto o tecido não fixado deve ser imediatamente processado.</li>
</ol>4. Criosection hemilarynx em avião longitudinal
<ol><li>Com a câmara criostata novamente definida para -20 °C, mude a espessura da seção para 30 μm. NOTA: Para a análise do NMJ, uma espessura tecidual entre 30-60 μm pode ser usada para capturar vários NMJs completos dentro dos músculos laríngeos sem fragmentação do terminal nervoso ou da placa final do motor11,12,17.</li>
	<li>Para obter seções longitudinal de dobra vocal para análise nmj do músculo TA, afixar os espécimes ao mandril de modo que a epiglote é orientada para a lâmina criostata e o lúmen traqueal voltado para baixo em direção ao disco do espécime.</li>
	<li>Corte o composto OCT avançando a cabeça da amostra em 100 μm até que a cartilagem da tireoide apareça.</li>
	<li>Seções de corte e faixa de 30 μm desde o início da tireoide até que a álmina propria e divisões medial e lateral do músculo TA sejam expostas. NOTA: Cinco conjuntos de marcos laríngeos no plano longitudinal são recomendados para rastrear a progressão da profundidade tecidual em direção ao músculo TA alvo. A Figura 3 representa os marcos laríngeos no plano longitudinal a 10x de ampliação.</li>
	<li>Uma vez alcançado o músculo TA alvo, colete seções em slides carregados positivamente a 30 μm.</li>
	<li>Armazene seções em PBS a 4 °C para reter a umidade até que estejam prontas para serem manchadas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Preparar dobras vocais de ratos para análise neuromuscular pode apresentar vários desafios. Não só os músculos laríngeos são pequenos e cercados por cartilagem, dificultando a extração direta do músculo alvo, a alta variabilidade também foi encontrada entre os animais na profundidade de marcos anatômicos laríngeos. Para o protocolo de plano transversal, as seções completas das dobras vocais apareceram entre 21-85 seções (10 μm por seção) após o aparecimento inicial da cartilagem da tireoide ventral, ...

A laringe de ratos é um modelo bem estabelecido para investigar adaptações de laringe neuromuscular estrutural e funcional para o desenvolvimento, envelhecimento, doença e agentes farmacológicos1,2,3,4,5. A consistência dos métodos histológicos é fundamental para essa linha de trabalho, pois há múltiplas complexidades envolvidas na preparação e análise muscular, bem como desafios associados ao tamanho, forma e topografia laríngeos dos músculos encapsulados dentro das cartilagens laríngeas1,6,7,8,9,10,11 . Devido ao pequeno tamanho dos músculos laríngeos intrínsecos do rato, incorporação sistemática, congelamento e criosecção são fundamentais para alcançar resultados consistentes e precisos. Por exemplo, ao seccionar a dobra vocal do rato no plano coronal, as junções neuromusculares (NMJs) de quatro dos músculos laríngeos intrínsecos estão localizadas dentro de menos de 1,8 mm de profundidade tecidual11. Portanto, o monitoramento preciso da anatomia muscular laríngea durante a criosecção é imperativo para identificar com precisão a seção de interesse e evitar o oversectioning do tecido. O oversectioning do músculo alvo pode resultar em identificação imprecisa do número e topografia de NMJs11 ou pode resultar em reduções globais no tamanho da amostra se o músculo alvo for descartado devido à confusão de orientação de marco12. À medida que novos modelos para o estudo do músculo laríngeo e suas respectivas adaptações são desenvolvidos, procedimentos operacionais padrão são essenciais para garantir que os resultados sejam precisos, confiáveis e reprodutíveis em todos os estudos.
O objetivo deste artigo é detalhar a preparação da dobra vocal de rato para uma análise longitudinal e transversal ideal. Métodos detalhados usados regularmente em nosso laboratório são descritos para identificar marcos musculares alvo durante a crioseção. Embora métodos semelhantes sejam usados em vários laboratórios, maiores detalhes são fornecidos aqui do que na literatura para garantir uma replicação confiável e precisa quando implementado por investigadores iniciantes. O objetivo deste tutorial é fornecer uma metodologia padrão para avaliação imunohistoquímica (IHC) da dobra vocal de ratos para melhorar a consistência entre laboratórios e investigações.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

O objetivo deste tutorial é descrever a preparação da dobra vocal de rato para o estudo neuromuscular histoquímico. Este protocolo descreve procedimentos para dissecção laríngea de ratos, congelamento de flash e criosectioning das dobras vocais. Este estudo descreve como criosecção dobras vocais em planos longitudinais e transversais. Uma novidade deste protocolo é o rastreamento laríngeo durante a criosecção que garante a identificação precisa dos músculos laríngeos intrínsecos e reduz a chance de perda de tecido. Os números demonstram a crioseção progressiva em ambos os planos. Vinte e nove hemi-laringes de ratos foram criosectionados e rastreados desde o surgimento da cartilagem tireoide até o aparecimento da primeira seção que incluía a dobra vocal completa. A dobra vocal completa foi visualizada para todos os animais em ambos os planos. Houve alta variabilidade na distância do aparecimento da cartilagem tireoide ao aparecimento da dobra vocal completa em ambos os planos. O peso não foi correlacionado à profundidade dos marcos laríngeos, sugerindo que a variabilidade individual e outros fatores relacionados à preparação tecidual podem ser responsáveis pela alta variabilidade no aparecimento de marcos durante a secção. Este estudo detalha uma metodologia e apresenta dados morfológicos para a preparação da dobra vocal de ratos para investigação neuromuscular histoquímica. Devido à alta variabilidade individual, os marcos laríngeos devem ser acompanhados de perto durante a crioseção para evitar a perda de tecido e tecido overfando. O uso de uma metodologia consistente, incluindo a preparação adequada do tecido e a conscientização de marcos dentro da laringe de ratos, auxiliará em resultados consistentes em estudos e ajudará novos pesquisadores interessados em usar a dobra vocal de ratos como modelo para investigar mecanismos neuromusculares laríngeos.

Os resultados representativos foram parte de uma investigação contínua dos efeitos do exercício vocal no sistema neuromuscular laríngeo. Vinte e nove ratos Fischer 344/marrom da Noruega (12 de 9 meses, 17 24 meses) foram pesados e eutanásia com inalação de CO2 seguida de uma toracotomia bilateral.
Os procedimentos seguiram o protocolo delineado para rotular NMJs e tamanho de fibra dos músculos TS lateral e medial. A distância entre os marcos laríngeos foi rastreada em pla...

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Este protocolo descreve métodos usados para preparar dobras vocais de ratos para estudo neuromuscular histoquímico.

Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.6K visualizações.  New York University School of Medicine. Este protocolo descreve métodos usados para preparar dobras vocais de ratos para estudo neuromuscular histoquímico.

Vídeo: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Neurociência

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

Formação específica de vocalizações ultra-som em ratos idosos e Parkinson

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

A infusão subcutânea de neurotrofina 4 com bombas osmóticas ou injeção muscular direta melhora o envelhecimento dos músculos da laringe do rato

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Biologia do Desenvolvimento

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Um modelo murino de Spinal Cord Injury do colo do útero para o Estudo de pós-lesional respiratória Neuroplasticidade

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Medicina

Impressão 3D de modelos de pregas vocais de silicone multicamadas

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

Autor em destaque: Avanços na fabricação de modelos sintéticos de pregas vocais para aplicações fonéticas e robóticas

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

Processo de Fabricação para Modelos de Pregas Vocais Supermacias Não Aderentes

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Engenharia

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Avaliação In Vivo das Propriedades Mecanicas e Viscoelásticas da Língua do Rato

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Endoscopic Approach for Studying Laryngeal Dysfunction in Rodents

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares

Resumo

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Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

Formação específica de vocalizações ultra-som em ratos idosos e Parkinson

A infusão subcutânea de neurotrofina 4 com bombas osmóticas ou injeção muscular direta melhora o envelhecimento dos músculos da laringe do rato

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Um modelo murino de Spinal Cord Injury do colo do útero para o Estudo de pós-lesional respiratória Neuroplasticidade

Processo de Fabricação para Modelos de Pregas Vocais Supermacias Não Aderentes

Processo de Fabricação para Modelos de Pregas Vocais Supermacias Não Aderentes

Processo de Fabricação para Modelos de Pregas Vocais Supermacias Não Aderentes

Avaliação In Vivo das Propriedades Mecanicas e Viscoelásticas da Língua do Rato

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close-Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing