Esta investigación fue apoyada por las subvenciones F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) y K23DC014517 (Johnson, PI) del Instituto Nacional de Sordera y otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud.

Este estudio se realizó de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York.
1. Diseccionar la laringe de la rata
<ol><li>Eutanasia de rata de acuerdo con el protocolo aprobado institucionalmente. Afeitar el cuello ventral desde la mandíbula hasta el manubrium e hisopo con alcohol para evitar la contaminación del pelaje en las muestras de tejido.</li>
	<li>Bajo un endoscopio de disección con aumento de 10x extirpar toda la laringe creando una incisión en la línea media del cuello con un bisturí hasta que la tráquea esté expuesta.</li>
	<li>Separe los músculos laríngeos extrínsecos ventrales en la línea media para exponer la laringe usando fórceps y diseccionando tijeras o un bisturí.</li>
	<li>Corte la tráquea caudal hasta el tercer anillo traqueal y haga una incisión rostral en el hueso hioides para extirpar toda la laringe con tijeras de disección.</li>
	<li>Extraiga los tejidos laríngeos extrínsecos (esófago, glándula tiroides y músculos laríngeos extrínsecos) de la laringe utilizando herramientas de microdisección (pinzas, alfileres y microescisores) bajo aumento.</li>
	<li>Con microscisores, divida la laringe dorsalmente entre los aritenoides utilizando la línea media entre los músculos cricoaritenoides posteriores como punto de referencia. Pin paredes laterales de la laringe para exponer las cuerdas vocales y luego dividir ventralmente a través de la línea media del cartílago tiroideo entre la comisura anterior de las cuerdas vocales con microscisores (Figura 1). NOTA: Este paso puede ser opcional; se puede omitir para mantener la laringe entera. La bisección de las laringes permite múltiples técnicas de inmunotinción utilizando por separado los lados derecho e izquierdo de la misma laringe.</li>
	<li>Enjuague cada hemilacinge en solución tamponada con fosfato (PBS) durante ~ 10 s y seque delicadamente con un limpiaparabrisas de tareas para reducir la formación de cristales de hielo durante la congelación.</li>
</ol>2. Fijar y/o congelar el tejido laríngeo
NOTA: La fijación puede no ser ideal para todos los protocolos de inmunotinción. A menudo, los tejidos laríngeos se congelan frescos inmediatamente después de la disección. Omita el paso 2.1 para congelar el tejido laríngeo sin fijación.
<ol><li>Para fijar hemilaringes, coloque los tejidos en un tubo de centrífuga lleno de formaldehído al 4% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador orbital a 70 rpm. Transfiera los tejidos a un tubo de centrífuga limpio y enjuague 3 veces durante 20 minutos en PBS. Luego transfiera a un tubo de centrífuga limpio y sumérjalo en una solución de sacarosa al 20% / glicerol al 5% (~ 18 h o hasta que el tejido se hunda) a 4 ° C. PRECAUCIÓN: El formaldehído es peligroso y debe usarse en una campana extractora de humos junto con el equipo de protección personal adecuado.</li>
	<li>Coloque todos los hemi-laringnges en una posición uniforme en un criomolde lleno de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Para una hemilaringe, coloque el tejido con la superficie medial de la cuerda vocal mirando hacia la parte inferior del criomold y el aspecto longitudinal del pliegue vocal paralelo al borde inferior de la abertura criomold. Para laringes enteros, coloque el tejido con los cricoaritenoides posteriores mirando hacia la parte inferior del criomold y el aspecto longitudinal de la cuerda vocal paralelo al borde inferior de la abertura criomal. NOTA: La orientación laríngea consistente dentro del compuesto oct es fundamental para la criosecciona de la cuerda vocal de la rata. Una vez que la hemilinge está incrustada y congelada, debe descongelarse para cambiar su orientación, introduciendo así riesgos de daño tisular por múltiples ciclos de descongelación-congelación.</li>
	<li>Tejidos de congelación instantánea utilizando isopentano (2-metilbutano) refrigerados en un vaso de precipitados de acero rodeado de nitrógeno líquido. NOTA: El isopentano alcanza la temperatura óptima para la congelación del tejido cuando los precipitados blancos comienzan a formarse en los lados y la parte inferior del vaso de precipitados13. El isopentano se usa porque tiene una conductividad térmica más alta que el nitrógeno líquido, lo que ayuda a prevenir el agrietamiento del bloque de tejido durante la congelación rápida. Para una descripción más detallada del tejido congelado en OTC, consulte Kumar et al.13.</li>
	<li>Envuelva cada molde en papel de aluminio preetiquetado y colóquelo en una bolsa de congelador individual para evitar la deshidratación y guárdelo inmediatamente en hielo seco hasta que se transfiera para su almacenamiento en un congelador de -80 ° C.</li>
</ol>3. Hemilaringe criosectante en plano transversal
<ol><li>Ajuste la temperatura de la cámara en el criostato a -20 ° C, que se encuentra en el medio del rango de temperatura (15-25 ° C) recomendado para la sección del tejido muscular por el manual del fabricante.</li>
	<li>Ajuste el grosor de la sección del criostato a secciones de 10 μm de espesor. NOTA: Para el análisis transversal de fibras musculares, las secciones de 10 μm de espesor son óptimas para permitir una tinción completa y una intensidad de imagen robusta de las fibras musculares marcadas para el análisis de tipificación de fibras14,15,16. Algunos protocolos pueden requerir diferentes grosores de sección dependiendo de los objetivos neuromusculares.</li>
	<li>Transfiera los tejidos a la cámara de criostato, agregue una capa uniforme de compuesto de OCT en el disco de muestra de criostato (chuck) y coloque el bloque de tejido incrustado encima del compuesto de OCT en el disco de muestra. Para obtener secciones transversales de la cuerda vocal para el análisis de la fibra muscular tiroaritenoide (TA), coloque la muestra en el mandril de modo que el cartílago tiroideo ventral se enfrente a la hoja del criostato y el cartílago aritenoide se enfrente al disco de la muestra. NOTA: Es fundamental tener en cuenta que estos puntos de referencia no son visibles en esta etapa, debido a que el compuesto OCT se vuelve blanco y opaco cuando se congela. Esta falta de visibilidad es la razón por la que es fundamental tener en cuenta la orientación de la hemilinge durante la etapa de congelación del flash.</li>
	<li>Recorte el compuesto oct haciendo avanzar la cabeza de la muestra en 100 μm hasta que aparezca la porción ventral del cartílago tiroideo.</li>
	<li>Luego recorte y rastree secciones de 30 μm desde el inicio del cartílago tiroideo hasta que se expongan la lámina propia, los músculos medial TA y el músculo TA lateral. NOTA: Los puntos de referencia laríngeos deben rastrearse y anotarse desde el inicio del cartílago tiroideo cada 100 μm para garantizar que el ángulo de seccionamiento no sea oblicuo. La Figura 2 representa los dos conjuntos de puntos de referencia laríngeos en el plano de la sección transversal con un aumento de 10x.</li>
	<li>Una vez que se alcanza el músculo TA objetivo, recoja secciones en diapositivas cargadas positivamente a 10 μm.</li>
	<li>Guarde las secciones en PBS a 4 °C para retener la humedad hasta que estén listas para teñirse. NOTA: El tejido fijo se puede almacenar en PBS hasta una semana dependiendo del objetivo de IHC, mientras que el tejido no fijo debe procesarse de inmediato.</li>
</ol>4. Criosectación hemilaríngea en plano longitudinal
<ol><li>Con la cámara de criostato nuevamente ajustada a -20 °C, cambie el grosor de la sección a 30 μm. NOTA: Para el análisis de NMJ, se puede utilizar un espesor tisular entre 30-60 μm para capturar varios NMJ completos dentro de los músculos laríngeos sin fragmentación de la terminal nerviosa o la placa terminal motora11,12,17.</li>
	<li>Para obtener secciones longitudinales de las cuerdas vocales para el análisis NMJ del músculo TA, fije las muestras al mandril de modo que la epiglotis esté orientada hacia la hoja del criostato y la luz traqueal mire hacia abajo hacia el disco de la muestra.</li>
	<li>Recorte el compuesto oct haciendo avanzar la cabeza de la muestra en 100 μm hasta que aparezca el cartílago tiroideo.</li>
	<li>Recorte y rastree secciones de 30 μm desde el inicio de la tiroides hasta que la lámina propia y las divisiones medial y lateral del músculo TA estén expuestas. NOTA: Se recomiendan cinco conjuntos de puntos de referencia laríngeos en el plano longitudinal para rastrear la progresión de la profundidad del tejido hacia el músculo TA objetivo. La Figura 3 representa los puntos de referencia laríngeos en el plano longitudinal a un aumento de 10x.</li>
	<li>Una vez que se alcanza el músculo TA objetivo, recoja secciones en diapositivas cargadas positivamente a 30 μm.</li>
	<li>Guarde las secciones en PBS a 4 °C para retener la humedad hasta que estén listas para teñirse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación de las cuerdas vocales de las ratas para el análisis neuromuscular puede presentar varios desafíos. Los músculos laríngeos no solo son pequeños y están rodeados de cartílago, lo que dificulta la extracción directa del músculo objetivo, sino que también se encontró una alta variabilidad entre los animales en la profundidad de los puntos de referencia anatómicos laríngeos. Para el protocolo del plano de sección transversal muscular, las secciones completas de las cuerdas vocales aparecieron en...

La laringe de rata es un modelo bien establecido para investigar las adaptaciones laríngeas neuromusculares estructurales y funcionales al desarrollo, el envejecimiento, la enfermedad y los agentes farmacológicos1,2,3,4,5. La consistencia de los métodos histológicos es fundamental para esta línea de trabajo, ya que existen múltiples complejidades involucradas en la preparación y el análisis muscular, así como desafíos asociados con el tamaño, la forma y la topografía de la laringe de los músculos encapsulados dentro de los cartílagos laríngeos1,6,7,8,9,10,11 . Debido al pequeño tamaño de los músculos laríngeos intrínsecos de la rata, la incrustación sistemática, la congelación y la crioseccionación son fundamentales para lograr resultados consistentes y precisos. Por ejemplo, al seccionar la cuerda vocal de la rata en el plano coronal, las uniones neuromusculares (NMJ) de cuatro de los músculos laríngeos intrínsecos se encuentran a menos de 1,8 mm de profundidad tisular11. Por lo tanto, el monitoreo preciso de la anatomía del músculo laríngeo durante la criosecciona es imperativo para identificar con precisión la (s) sección (s) de interés y evitar la sobreseccionamiento del tejido. La sobresección del músculo objetivo puede dar lugar a una identificación inexacta del número y la topografía de nmJs11 o puede dar lugar a reducciones generales en el tamaño de la muestra si el músculo objetivo se descarta debido a la confusión de orientación de punto de referencia12. A medida que se desarrollan nuevos modelos para el estudio del músculo laríngeo y sus respectivas adaptaciones, los procedimientos operativos estándar son esenciales para garantizar que los resultados sean precisos, confiables y reproducibles en todos los estudios.
El objetivo de este artículo es detallar la preparación de la cuerda vocal de la rata para un análisis longitudinal y transversal óptimo. Se describen métodos detallados utilizados regularmente en nuestro laboratorio para identificar puntos de referencia musculares objetivo durante la crioseccionación. Aunque se utilizan métodos similares en varios laboratorios, aquí se proporciona un mayor detalle que en la literatura para garantizar una replicación confiable y precisa cuando es implementada por investigadores novatos. El objetivo de este tutorial es proporcionar una metodología estándar para la evaluación inmunohistoquímica (IHC) de la cuerda vocal de la rata para mejorar la consistencia en los laboratorios e investigaciones.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

El propósito de este tutorial es describir la preparación de la cuerda vocal de la rata para el estudio neuromuscular histoquímico. Este protocolo describe los procedimientos para la disección laríngea de ratas, la congelación por flash y la crioseccionación de las cuerdas vocales. Este estudio describe cómo crioseccionar las cuerdas vocales tanto en planos longitudinales como transversales. Una novedad de este protocolo es el seguimiento laríngeo durante la crioseccionación que garantiza la identificación precisa de los músculos laríngeos intrínsecos y reduce la posibilidad de pérdida de tejido. Las cifras demuestran la crioseccionación progresiva en ambos planos. Veintinueve hemi-laringes de rata fueron crioseccionados y rastreados desde la aparición del cartílago tiroideo hasta la aparición de la primera sección que incluía el pliegue vocal completo. La cuerda vocal completa se visualizó para todos los animales en ambos planos. Hubo una alta variabilidad en la distancia desde la aparición del cartílago tiroideo hasta la aparición de la cuerda vocal completa en ambos planos. El peso no se correlacionó con la profundidad de los puntos de referencia laríngeos, lo que sugiere que la variabilidad individual y otros factores relacionados con la preparación del tejido pueden ser responsables de la alta variabilidad en la aparición de puntos de referencia durante la sección. Este estudio detalla una metodología y presenta datos morfológicos para la preparación de la cuerda vocal de la rata para la investigación neuromuscular histoquímica. Debido a la alta variabilidad individual, los puntos de referencia laríngeos deben rastrearse de cerca durante la criosecciona para evitar la sobresección del tejido y la pérdida de tejido. El uso de una metodología consistente, incluida la preparación adecuada del tejido y el conocimiento de los puntos de referencia dentro de la laringe de la rata, ayudará con resultados consistentes en todos los estudios y ayudará a los nuevos investigadores interesados en usar el pliegue vocal de la rata como modelo para investigar los mecanismos neuromusculares laríngeos.

Los resultados representativos fueron parte de una investigación en curso de los efectos del ejercicio vocal en el sistema neuromuscular laríngeo. Veintinueve machos de ratas Fischer 344/brown Norway (12 de 9 meses de edad, 17 de 24 meses de edad) fueron pesadas y sacrificadas con inhalación de CO2 seguida de una toracotomía bilateral.
Los procedimientos siguieron el protocolo descrito para etiquetar nmj y el tamaño de la fibra de los músculos LATERALES y mediales de la AT. La...

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Este protocolo describe los métodos utilizados para preparar las cuerdas vocales de las ratas para el estudio neuromuscular histoquímico.

Preparación de la cuerda vocal de la rata para análisis neuromusculares

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.6K vistas.  New York University School of Medicine. Este protocolo describe los métodos utilizados para preparar las cuerdas vocales de las ratas para el estudio neuromuscular histoquímico.

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Caracterización fisiológicas, morfológicas y neuroquímicas de las neuronas modulada por el Movimiento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Investigación

Neurociencias

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

La formación específica de las vocalizaciones de ultrasonidos en las ratas viejas y Parkinson

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

La infusión subcutánea de neurotrofina 4 con bombas osmóticas o inyección muscular directa mejora el envejecimiento de los músculos laríngeos de la rata

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Biología del Desarrollo

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Un modelo murino de la médula espinal cervical Lesión en estudio post-lesional Respiratorio Neuroplasticidad

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Medicina

Impresión 3D de modelos de cuerdas vocales de silicona multicapa

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

Autor destacado: Avances en la fabricación de modelos de cuerdas vocales sintéticas para aplicaciones fonéticas y robóticas

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

Proceso de fabricación para modelos de cuerdas vocales supersuaves no adhesivas

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Ingeniería

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Evaluación in vivo de las propiedades mecánicas y viscoelásticas de la lengua de rata

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Endoscopic Approach for Studying Laryngeal Dysfunction in Rodents

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

Preparación de la cuerda vocal de la rata para análisis neuromusculares

Resumen

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Capítulos en este video

Caracterización fisiológicas, morfológicas y neuroquímicas de las neuronas modulada por el Movimiento

La formación específica de las vocalizaciones de ultrasonidos en las ratas viejas y Parkinson

La infusión subcutánea de neurotrofina 4 con bombas osmóticas o inyección muscular directa mejora el envejecimiento de los músculos laríngeos de la rata

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Un modelo murino de la médula espinal cervical Lesión en estudio post-lesional Respiratorio Neuroplasticidad

Proceso de fabricación para modelos de cuerdas vocales supersuaves no adhesivas

Proceso de fabricación para modelos de cuerdas vocales supersuaves no adhesivas

Proceso de fabricación para modelos de cuerdas vocales supersuaves no adhesivas

Evaluación in vivo de las propiedades mecánicas y viscoelásticas de la lengua de rata

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close-Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing