Diese Forschung wurde durch die Zuschüsse F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) und K23DC014517 (Johnson, PI) des National Institute on Deafness and other Communication Disorders der National Institutes of Health unterstützt.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der New York University School of Medicine durchgeführt.
1. Zerlegen Sie den Kehlkopf der Ratte
<ol><li>Euthanasierung der Ratte gemäß dem institutionell genehmigten Protokoll. Rasieren Sie den ventralen Hals vom Unterkiefer bis zum Manubrium und tupfen Sie ihn mit Alkohol ab, um eine Fellkontamination in den Gewebeproben zu verhindern.</li>
	<li>Unter einem Sezierfernrohr mit 10-facher Vergrößerung wird der gesamte Kehlkopf ausgeschnitten, indem mit einem Skalpell ein Mittellinien-Halsschnitt erstellt wird, bis die Luftröhre freigelegt wird.</li>
	<li>Trennen Sie die ventralen extrinsischen Kehlkopfmuskeln an der Mittellinie, um den Kehlkopf mit einer Pinzette und einer Schere oder einem Skalpell freizulegen.</li>
	<li>Trennen Sie die Luftröhre kaudal zum dritten Trachealring und machen Sie einen Rostralschnitt zum Zungenbein, um den gesamten Kehlkopf mit einer Sezierschere zu entfernen.</li>
	<li>Entfernen Sie das extrinsische Kehlkopfgewebe (Speiseröhre, Schilddrüse und extrinsische Kehlkopfmuskeln) mit Mikrodesektionswerkzeugen (Pinzette, Stifte und Mikroscheren) unter Vergrößerung aus dem Kehlkopf.</li>
	<li>Mit Mikroscheren den Kehlkopf dorsal zwischen den Arytenoiden halbieren, wobei die Mittellinie zwischen den hinteren Cricoarytenoidmuskeln als Orientierungspunkt verwendet wird. Pin seitenwände des Kehlkopfes, um die Stimmlippen freizulegen, und halbieren Sie dann ventral durch die Mittellinie des Schilddrüsenknorpels zwischen der vorderen Kommissur der Stimmlippen mit Mikroscheren (Abbildung 1). HINWEIS: Dieser Schritt kann optional sein. es kann übersprungen werden, um den Kehlkopf ganz zu halten. Die Bisektion von Kehlköpfen ermöglicht mehrere Immunfärbungstechniken, indem die rechte und linke Seite desselben Kehlkopfes getrennt verwendet wird.</li>
	<li>Spülen Sie jeden Hemi-Larynx in phosphatgepufferter Lösung (PBS) für ~ 10 s und trocknen Sie ihn vorsichtig mit einem Task-Wischer, um die Eiskristallbildung während des Einfrierens zu reduzieren.</li>
</ol>2. Larynxgewebe fixieren und/oder schockgefrieren
HINWEIS: Die Fixierung ist möglicherweise nicht für alle Immunfärbungsprotokolle ideal. Oft werden Kehlkopfgewebe unmittelbar nach der Dissektion frisch schockgefroren. Überspringen Sie Schritt 2.1, um Kehlkopfgewebe ohne Fixierung einzufrieren.
<ol><li>Zur Fixierung von Hemi-Laryngen legen Sie Gewebe in ein mit 4% Formaldehyd gefülltes Zentrifugenröhrchen in PBS für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 70 U / min. Gewebe in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und 3x für 20 min in PBS abspülen. Dann in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und bei 4 °C in eine 20% ige Saccharose/5%ige Glycerinlösung (~18 h oder bis das Gewebe sinkt) tauchen. VORSICHT: Formaldehyd ist gefährlich und sollte zusammen mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung in einem Abzug verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie alle Hemi-Laryngen in eine gleichmäßige Position in eine Kryoform, die mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) gefüllt ist. Für einen Hemilarynx platzieren Sie das Gewebe mit der medialen Oberfläche der Stimmlippe, die der Unterseite der Kryomold zugewandt ist, und dem Längsaspekt der Stimmlippe parallel zum unteren Rand der Kryomalöffnung. Für ganze Laryngen platzieren Sie das Gewebe mit den hinteren Cricoarytenoiden, die der Unterseite der Kryomold und dem Längsaspekt der Stimmlippe zugewandt sind, parallel zum unteren Rand der Kryomalöffnung. HINWEIS: Eine konsistente Kehlkopforientierung innerhalb der OCT-Verbindung ist entscheidend für die Kryosektion der Stimmlippe der Ratte. Sobald der Hemilarynx eingebettet und eingefroren ist, muss er aufgetaut werden, um seine Orientierung zu ändern, wodurch das Risiko von Gewebeschäden durch mehrere Tau-Gefrier-Zyklen entsteht.</li>
	<li>Schockfrostgewebe mit Isopentan (2-Methylbutan), gekühlt in einem Stahlbecherglas, umgeben von flüssigem Stickstoff. HINWEIS: Das Isopentan erreicht eine optimale Temperatur für das Einfrieren des Gewebes, wenn sich weiße Ausscheidungen an den Seiten und am Boden des Becherglases bilden13. Isopentan wird verwendet, weil es eine höhere Wärmeleitfähigkeit als flüssiger Stickstoff aufweist, was ein Reißen des Gewebeblocks beim schnellen Einfrieren verhindert. Für eine detailliertere Beschreibung des Einfrierens von Gewebe bei OTC siehe Kumar et al.13.</li>
	<li>Wickeln Sie jede Form in voretikettierte Folie und legen Sie sie in einen einzelnen Gefrierbeutel, um Austrocknung zu verhindern, und lagern Sie sie sofort auf Trockeneis, bis sie zur Lagerung in einem -80 ° C-Gefrierschrank überführt werden.</li>
</ol>3. Kryosektions-Hemilarynx in der Querschnittsebene
<ol><li>Stellen Sie die Kammertemperatur im Kryostaten auf -20 °C ein, was in der Mitte des Temperaturbereichs (15−25 °C) liegt, der im Handbuch des Herstellers für die Muskelgewebeschnitte empfohlen wird.</li>
	<li>Stellen Sie die Dicke des Kryostatenabschnitts auf 10 μm dicke Abschnitte ein. HINWEIS: Für die Muskelfaserquerschnittsanalyse sind 10 μm dicke Abschnitte optimal, um eine vollständige Färbung und eine robuste Bildgebungsintensität der markierten Muskelfasern für die Fasertypisierungsanalyse zu ermöglichen14,15,16. Einige Protokolle können je nach neuromuskulären Zielen eine unterschiedliche Abschnittsdicke erfordern.</li>
	<li>Übertragen Sie Gewebe in die Kryostatenkammer, fügen Sie eine gleichmäßige Schicht OCT-Verbindung auf die Kryostatprobenscheibe (Chuck) hinzu und legen Sie den eingebetteten Gewebeblock auf die OCT-Verbindung auf die Probenscheibe. Um Querschnitte der Stimmlippe für die Thyroarytenoid (TA) Muskelfaseranalyse zu erhalten, befestigen Sie die Probe am Chuck, so dass der ventrale Schilddrüsenknorpel der Kryostatenklinge und der Arytenoidknorpel der Probenscheibe zugewandt ist. HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Landmarken zu diesem Zeitpunkt nicht sichtbar sind, da die OCT-Verbindung beim Einfrieren weiß und undurchsichtig wird. Dieser Mangel an Sichtbarkeit ist der Grund, warum es wichtig ist, die Ausrichtung des Hemilarynx während des Schockfroststadiums zu beachten.</li>
	<li>Trimmen Sie die OCT-Verbindung, indem Sie den Probenkopf um 100 μm vorrücken, bis der ventrale Teil des Schilddrüsenknorpels erscheint.</li>
	<li>Dann trimmen und verfolgen Sie 30 μm Abschnitte vom Beginn des Schilddrüsenknorpels bis die Lamina propria, die medialen TA-Muskeln und der laterale TA-Muskel freigelegt sind. HINWEIS: Kehlkopfmarkierungen sollten vom Beginn des Schilddrüsenknorpels alle 100 μm verfolgt und notiert werden, um sicherzustellen, dass der Schnittwinkel nicht schräg ist. Abbildung 2 zeigt die beiden Sätze von Kehlkopf-Landmarken in der Querschnittsebene bei 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Sobald der Ziel-TA-Muskel erreicht ist, sammeln Sie Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern bei 10 μm.</li>
	<li>Lagern Sie die Abschnitte in PBS bei 4 °C, um Feuchtigkeit zu speichern, bis sie zum Färben bereit sind. HINWEIS: Festes Gewebe kann je nach IHC-Ziel bis zu einer Woche in PBS gelagert werden, während nicht fixiertes Gewebe sofort verarbeitet werden sollte.</li>
</ol>4. Kryosektions-Hemilarynx in Längsebene
<ol><li>Wenn die Kryostatenkammer wieder auf -20 °C eingestellt ist, ändern Sie die Querschnittsdicke auf 30 μm. HINWEIS: Für die NMJ-Analyse kann eine Gewebedicke zwischen 30−60 μm verwendet werden, um mehrere vollständige NMJs innerhalb der Kehlkopfmuskulatur ohne Fragmentierung der Nervenend- oder motorischen Endplatte zu erfassen11,12,17.</li>
	<li>Um longitudinale Stimmlippenschnitte für die NMJ-Analyse des TA-Muskels zu erhalten, befestigen Sie die Proben am Chuck, so dass die Epiglottis auf die Kryostatenklinge ausgerichtet ist und das Tracheallumen nach unten zur Probenscheibe zeigt.</li>
	<li>Trimmen Sie die OCT-Verbindung, indem Sie den Probenkopf um 100 μm vorrücken, bis der Schilddrüsenknorpel erscheint.</li>
	<li>Trimm- und Spurabschnitte von 30 μm vom Einsetzen der Schilddrüse bis zur Lamina propria sowie mediale und laterale Unterteilungen des TA-Muskels werden freigelegt. HINWEIS: Fünf Sätze von Kehlkopfmarkierungen in der Längsebene werden empfohlen, um die Progression der Gewebetiefe in Richtung des Ziel-TA-Muskels zu verfolgen. Abbildung 3 zeigt die Kehlkopfmarkerpunkte in der Längsebene bei 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Sobald der Ziel-TA-Muskel erreicht ist, sammeln Sie Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern bei 30 μm.</li>
	<li>Lagern Sie die Abschnitte in PBS bei 4 °C, um Feuchtigkeit zu speichern, bis sie zum Färben bereit sind.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Vorbereitung der Stimmlippen von Ratten für die neuromuskuläre Analyse kann verschiedene Herausforderungen mit sich bringen. Die Kehlkopfmuskulatur ist nicht nur klein und von Knorpel umgeben, was es schwierig macht, den Zielmuskel direkt zu extrahieren, sondern es wurde auch eine hohe Variabilität zwischen Tieren in der Tiefe der anatomischen Kehlkopfmarkierungen festgestellt. Für das Protokoll der Querschnittsebene des Muskels traten vollständige Stimmlippenabschnitte zwischen 21-85 Abschnitten (10 μm pro Abs...

Der Kehlkopf der Ratte ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung struktureller und funktioneller neuromuskulärer Kehlkopfanpassungen an Entwicklung, Alterung, Krankheit und pharmakologische Wirkstoffe1,2,3,4,5. Die Konsistenz histologischer Methoden ist für diese Arbeit von entscheidender Bedeutung, da bei der Muskelvorbereitung und -analyse mehrere Feinheiten beteiligt sind, sowie Herausforderungen im Zusammenhang mit der Größe, Form und Topographie der in den Kehlkopfknorpeln eingekapselten Muskeln1,6,7,8,9,10,11 . Aufgrund der geringen Größe der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur der Ratte sind systematisches Einbetten, Einfrieren und Kryosektion entscheidend, um konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen. Wenn beispielsweise die Stimmlippe der Ratte in der koronalen Ebene geschnitten wird, befinden sich die neuromuskulären Verbindungen (NMJs) von vier der intrinsischen Kehlkopfmuskeln innerhalb von weniger als 1,8 mm Gewebetiefe11. Daher ist eine präzise Überwachung der Anatomie der Kehlkopfmuskulatur während der Kryosektion unerlässlich, um die interessierenden Abschnitte genau zu identifizieren und eine Übersektion des Gewebes zu verhindern. Eine Übersektion des Zielmuskels kann zu einer ungenauen Identifizierung der Anzahl und Topographie von NMJs11 oder zu einer Gesamtverringerung der Stichprobengröße führen, wenn der Zielmuskel aufgrund von Orientierungsverwechslungen verworfen wird12. Da neuartige Modelle für die Untersuchung des Kehlkopfmuskels und ihrer jeweiligen Anpassungen entwickelt werden, sind Standardarbeitsanweisungen unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse in allen Studien präzise, zuverlässig und reproduzierbar sind.
Ziel dieses Artikels ist es, die Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für eine optimale Längs- und Querschnittsanalyse detailliert zu beschreiben. Detaillierte Methoden, die regelmäßig in unserem Labor angewendet werden, werden beschrieben, um Zielmuskelmarker während der Kryosektion zu identifizieren. Obwohl ähnliche Methoden in mehreren Labors verwendet werden, werden hier mehr Details als in der Literatur bereitgestellt, um eine zuverlässige und genaue Replikation zu gewährleisten, wenn sie von unerfahrenen Forschern implementiert wird. Ziel dieses Tutorials ist es, eine Standardmethodik für die immunhistochemische (IHC) Bewertung der Rattengespinstfalte bereitzustellen, um die Konsistenz zwischen Labors und Untersuchungen zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

Der Zweck dieses Tutorials ist es, die Vorbereitung der Rattengespinstfalte für histochemische neuromuskuläre Studien zu beschreiben. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Larynxdissektion von Ratten, das Schockgefrieren und die Kryosektion der Stimmlippen. Diese Studie beschreibt, wie man Stimmlippen sowohl in Längs- als auch in Querschnittsebene kryosektioniert. Eine Neuheit dieses Protokolls ist die Kehlkopfverfolgung während der Kryosektion, die eine genaue Identifizierung der intrinsischen Kehlkopfmuskulatur gewährleistet und die Wahrscheinlichkeit eines Gewebeverlusts verringert. Die Abbildungen zeigen die fortschreitende Kryosektion in beiden Ebenen. Neunundzwanzig Ratten-Hemi-Laryngen wurden kryosektiert und vom Aufkommen des Schilddrüsenknorpels bis zum Erscheinen des ersten Abschnitts verfolgt, der die volle Stimmlippe enthielt. Die volle Stimmlippe wurde für alle Tiere in beiden Ebenen visualisiert. Es gab eine hohe Variabilität im Abstand vom Auftreten des Schilddrüsenknorpels bis zum Auftreten der vollen Stimmlippe in beiden Ebenen. Das Gewicht korrelierte nicht mit der Tiefe der Kehlkopfmarkierungen, was darauf hindeutet, dass die individuelle Variabilität und andere Faktoren im Zusammenhang mit der Gewebepräparation für die hohe Variabilität des Auftretens von Landmarken während des Schneidens verantwortlich sein könnten. Diese Studie beschreibt eine Methodik und präsentiert morphologische Daten zur Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für histochemische neuromuskuläre Untersuchungen. Aufgrund der hohen individuellen Variabilität sollten Kehlkopfmarkierungen während der Kryosektion genau verfolgt werden, um eine Übersektion von Gewebe und Gewebeverlust zu verhindern. Die Verwendung einer konsistenten Methodik, einschließlich einer angemessenen Gewebevorbereitung und des Bewusstseins für Landmarken im Kehlkopf der Ratte, wird zu konsistenten Ergebnissen in allen Studien beitragen und neuen Forschern helfen, die daran interessiert sind, die Stimmlippe der Ratte als Modell zur Untersuchung der neuromuskulären Kehlkopfmechanismen zu verwenden.

Die repräsentativen Ergebnisse waren Teil einer laufenden Untersuchung der Auswirkungen von Stimmübungen auf das kehlkopfe neuromuskuläre System. Neunundzwanzig männliche Fischer 344/braune Wanderratten (12 9 Monate alt, 17 24 Monate alt) wurden gewogen und mit CO2-Inhalation gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie eingeschläfert.
Die Verfahren folgten dem skizzierten Protokoll zur Kennzeichnung von NMJs und Fasergröße der lateralen und medialen TA-Muskeln. Der Abstand zwi...

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Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.6K Aufrufe.  New York University School of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Serie: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Forschung

Neurowissenschaften

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

Gezielte Schulung von Ultraschall Vocalizations in Aged und Parkinson-Ratten

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

Subkutane Neurotrophin-4-Infusion unter Verwendung von Osmotik-Pumpen oder direkter Muskel-Injektion verbessert die Ratten-Larynx-Muskeln

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Entwicklungsbiologie

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Einem Mausmodell der zervikalen Rückenmarksverletzung zu Post-läsionaler Atemneuroplastizität Studieren

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Medizin

3D-Druck von mehrschichtigen Silikon-Stimmlippenmodellen

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der Herstellung synthetischer Stimmlippenmodelle für phonetische und robotische Anwendungen

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

Herstellungsprozess für nicht klebende superweiche Stimmlippenmodelle

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Ingenieurwesen

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

In vivo Auswertung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Rattenzunge

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Endoscopic Approach for Studying Laryngeal Dysfunction in Rodents

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

Gezielte Schulung von Ultraschall Vocalizations in Aged und Parkinson-Ratten

Subkutane Neurotrophin-4-Infusion unter Verwendung von Osmotik-Pumpen oder direkter Muskel-Injektion verbessert die Ratten-Larynx-Muskeln

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Einem Mausmodell der zervikalen Rückenmarksverletzung zu Post-läsionaler Atemneuroplastizität Studieren

Herstellungsprozess für nicht klebende superweiche Stimmlippenmodelle

Herstellungsprozess für nicht klebende superweiche Stimmlippenmodelle

Herstellungsprozess für nicht klebende superweiche Stimmlippenmodelle

In vivo Auswertung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Rattenzunge

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close-Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing