Este protocolo descreve a produção de células T resus imunoterapêuticas que expressam duas proteínas: um receptor de antígeno quimérico antiviral e um receptor de quimioterapia CXCR5 que direciona as células para folículos linfoides. Este procedimento relativamente rápido de nove dias produz células T com fenótipo de memória central menos diferenciado com o potencial de persistente de longo prazo após a infusão em animais. Adaptar este método às células humanas permitirá a produção de células T imunoterapêuticas com o potencial de induzir uma remissão durável ao HIV sem a administração de drogas antirretrovirais.
Este método pode ser usado amplamente para produzir células T resus expressando outras proteínas de interesse. E com pequenas modificações, pode ser usado para gerar células T transduzidas em outras espécies, incluindo humanos. O sucesso da transdução depende de PBMCs estimulados saudáveis.
Deve-se tomar cuidado na coleta, transporte e armazenamento. Antes da transdução, é importante avaliar visualmente a estimulação das células. Comece descongelando PBMCs primários rhesus.
Incubar as células em um banho de água de 37 graus Celsius com agitação suave até que apenas uma pequena quantidade de gelo permaneça. Pipete suavemente as células em um tubo cônico. Em seguida, enxágüe o frasco com um mililitro de meio básico e adicione-o lentamente às células.
Adicione lentamente nove mililitros adicionais de meio básico quente às células. Coloque o tubo no recipiente resistente ao aerossol e centrífuga-o a 600 vezes g durante cinco minutos a 22 graus Celsius. Aspire o supernasce e resuspenque a pelota em uma pequena quantidade de meio de crescimento.
Para contar as células, adicione 10 microliters de células a 10 microliters de azul tripano. Carregue o slide da câmara e insira-o no balcão. Pressione o botão de captura para contar as células.
Calcule o número total de células multiplicando a concentração celular por volume e dilui-as para dois milhões de células por mililitro em meio de crescimento. Adicione anti-CD28 para uma concentração final de cinco microgramas por mililitro. Em seguida, pipeta de três a seis milhões de células por poço em placas revestidas anti-CD3.
Incubar as placas por dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Aqueça uma centrífuga a 32 graus Celsius executando-a a 2.000 vezes g por cerca de 30 minutos. Enquanto isso, aqueça tanto a mídia sem soro quanto a mídia de crescimento em um banho de água de 37 graus Celsius e descongele o vírus com um suave rodopio em um banho de água de 37 graus Celsius.
Então coloque no gelo. Diluir o vírus para uma multiplicidade ideal predeterminada de infecção em meio livre de soro. Adicione dois mililitros do retrovírus diluído a cada poço da placa revestida de fibronectina usando apenas a mídia para as células de controle negativas.
Coloque as placas na centrífuga pré-armada em microplacas e centrífugue-as a 2.000 vezes por duas horas. Se usar imediatamente, aspire a preparação do vírus a partir dos poços e adicione dois mililitros de meio de crescimento. Verifique os PBMCs estimulados sob um microscópio invertido.
As células devem ser redondas, brilhantes, e devem refratar a luz. Eles também devem ter uma aparência desajeitada indicando estimulação. Colete as células-alvo e transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros.
Enxágüe cada poço uma vez com um mililitro de meio de crescimento e adicione isso ao tubo. Em seguida, conte as células como demonstrado anteriormente. Pelotar as células centrifugando-as a 600 vezes g por cinco minutos a 32 graus Celsius.
Aspire a mídia da pelota e resuspenda as células em meio de crescimento a uma concentração de 1,5 milhão de células por mililitro. Adicione um mililitro da suspensão celular a cada poço revestido por vírus e adicione células transdutoras MAC a poços revestidos de fibronectina que não receberam vírus. Centrifugar as placas a 1.000 vezes g por 10 minutos a 32 graus Celsius e incuba-las a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
O trabalho com células rhesus e retrovírus gama requer o uso de equipamentos de proteção individual, como jalecos e luvas e o trabalho deve ser realizado em um armário de biossegurança. Todas as pipetas e soluções devem ser descontaminadas. Pipeta o conteúdo de cada poço para cima e para baixo com uma pipeta de cinco mililitros para resuspensar as células e transferi-las para um tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione um mililitro de meio de crescimento para cada poço e pipeta para cima e para baixo para remover células aderentes. Em seguida, conte as células como descrito anteriormente. Centrifugar as células a 600 vezes g por 10 minutos a 25 graus Celsius.
Em seguida, aspirar a mídia e resuspencar as células em mídia de expansão para uma concentração de um milhão de células por mililitro. Semente cinco mililitros de células em cada poço permeável de gás de uma placa de seis poços e cuidadosamente camada um adicional de 25 mililitros de mídia de expansão por poço. Em seguida, incubar as células sem ser perturbada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro dias.
Para coletar as células dos poços, remova e descarte 20 mililitros da mídia tomando cuidado para não perturbar as células. Pipeta a mídia restante para cima e para baixo para desalojar as células. Use uma pipeta de transferência estéril para enxaguar cada poço com três mililitros de mídia e coletar as células residuais.
Em seguida, conte-os para verificar se há número de celular e viabilidade. Este protocolo foi utilizado para transdução e expansão de células de seis animais diferentes. Os poços permeáveis de gás foram semeados a uma densidade inicial de cinco milhões de células e após quatro dias de crescimento, uma densidade mediana de 55,6 milhões de células por poço foi alcançada.
A viabilidade das células monitoradas pela exclusão azul de tripano foi mantida em 83 a 95% ao longo do protocolo. A citometria de fluxo foi utilizada para observar a co-expressão dos genes transduzidos. No quinto dia, uma mediana de 42,8% das células foram transduzidas tanto com CD4-MBL CAR quanto com CXCR5.
Enquanto no nono dia, a expressão mediana foi de 47,6% com uma única rodada de transdução. A citometria de fluxo também foi usada para monitorar o fenótipo da memória. Antes da transdução e expansão, foram identificadas populações ingênuas de memória central e de memória.
A população ingênua foi perdida com a colheita e as células eram principalmente células de memória central no quinto dia e no nono dia. O sucesso na transdução depende do uso de reagentes de alta qualidade, células altamente viáveis e vírus titulados, bem como consistentemente seguindo o tempo do protocolo. As células podem ser usadas para ensaios funcionais, incluindo ensaios de migração e supressão viral, bem como para infusão em animais para estudos pré-clínicos para testar a eficácia da imunoterapia.
Avançamos com testes pré-clínicos de células T CAR e CXCR5 em animais e esperamos testar em breve essa imunoterapia em indivíduos infectados pelo HIV.
