פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תאי T-t של רזוס אימונותרפי המבטאים שני חלבונים: קולטן אנטיגן כימרי אנטי ויראלי קולטן כימוקין CXCR5 כי תאים היעד זקיקי הלימפה. הליך מהיר יחסית זה בן תשעת הימים מייצר תאי T עם פנוטיפ זיכרון מרכזי פחות מובחן עם פוטנציאל להתמדה ארוכת טווח לאחר עירוי לבעלי חיים. התאמת שיטה זו לתאים אנושיים תאפשר ייצור של תאי T אימונותרפיים עם פוטנציאל לגרום הפוגה עמידה ל- HIV ללא מתן תרופות אנטי-רטרו-ויראליות.
שיטה זו יכולה לשמש באופן נרחב כדי לייצר רזוס T-תאים המביעים חלבונים אחרים של עניין. ועם שינויים קלים, זה יכול לשמש כדי ליצור תאי T מתומרים במינים אחרים כולל בני אדם. הצלחת ההתמרה תלויה ב-PBMCs מגורים בריאים.
יש לדאוג לאיסוף, הובלה ואחסון. לפני ההעתקה, חשוב להעריך חזותית את הגירוי של התאים. התחל על-ידי הפשרת מחשבי רזוס ראשיים.
הדגירה את התאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה עד רק כמות קטנה של קרח נשאר. בעדינות pipette התאים לתוך צינור חרוט. לאחר מכן לשטוף את הבקבוקון עם מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לאט להוסיף אותו לתאים.
לאט לאט להוסיף תשעה מיליליטר נוספים של מדיום בסיסי חם לתאים. מניחים את הצינור במיכל עמיד בתרסיס וצנטריפוגה אותו ב 600 פעמים g במשך חמש דקות ב 22 מעלות צלזיוס. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור בכמות קטנה של מדיום צמיחה.
כדי לספור את התאים, להוסיף 10 microliters של תאים 10 microliters של כחול טריפאן. טען את שקופית התא והוסף אותה לדלפק. לחץ על לחצן הלכידה כדי לספור את התאים.
לחשב את המספר הכולל של תאים על ידי הכפלת ריכוז התאים לפי נפח לדלל אותם לשני מיליון תאים למיליליטר במדיום הצמיחה. הוסף אנטי CD28 לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. ואז פיפטה שלושה עד שישה מיליון תאים לתוך צלחות מצופות אנטי CD3.
דגירה הצלחות במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. מחממים צנטריפוגה ל 32 מעלות צלזיוס על ידי הפעלתו ב 2, 000 פעמים g במשך כ 30 דקות. בינתיים, חם הן ללא סרום והן מדיה צמיחה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר את הנגיף עם מערבולת עדינה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
ואז למקם אותו על קרח. לדלל את הנגיף לריבוי אופטימלי קבוע מראש של זיהום במדיום ללא סרום. הוסף שני מיליליטר של רטרווירוס מדולל לכל באר של צלחת מצופה fibronectin באמצעות מדיה לבד עבור תאי הבקרה השליליים.
מניחים את הצלחות בצנטריפוגה מראש במנשאי מיקרופלאט וצנטריפוגה אותם ב 2,000 פעמים g במשך שעתיים. אם משתמשים מיד, שאפו את הכנת הנגיף מה בארות והוסיפו שני מיליליטר של מדיום צמיחה. בדוק את המחשבים הממריצים תחת מיקרוסקופ הפוך.
התאים צריכים להיות עגולים, בהירים, והם צריכים לנטרל אור. הם צריכים גם מראה מגושם המציין גירוי. לאסוף את תאי היעד ולהעביר אותם לצינור חרוט 50 מיליליטר.
לשטוף כל טוב פעם אחת עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה ולהוסיף את זה לצינור. לאחר מכן ספור את התאים כפי שהודגם קודם לכן. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 600 פעמים g במשך חמש דקות ב 32 מעלות צלזיוס.
שאף את התקשורת מהכדור והתן מחדש את התאים במדיום הצמיחה בריכוז של 1.5 מיליון תאים למיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה התא לכל היטב מצופה וירוס ולהוסיף MAC להתמר תאים בארות מצופה fibronectin שלא קיבל וירוס. צנטריפוגה הצלחות ב 1, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 32 מעלות צלזיוס ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.
עבודה עם תאי רזוס ורטרווירוסים גמא דורשת שימוש בציוד מגן אישי כגון חלוקי מעבדה וכפפות והעבודה חייבת להתבצע בארון ביו-בטיחותי. יש לפענח את כל הפיפטות והפתרונות. פיפטה התוכן של כל באר למעלה ולמטה עם פיפטה חמישה מיליליטר כדי להשתמש שוב את התאים ולהעביר אותם צינור חרוט 50 מיליליטר.
הוסף מיליליטר אחד של צמיחה בינוני לכל באר פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר תאים חסידים. לאחר מכן ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה התאים ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן שאף את התקשורת ולחץ מחדש על התאים במדיה התפשטות לריכוז של מיליון תאים למיליליטר. זרע חמישה מיליליטר של תאים לתוך כל גז חדיר היטב של צלחת שש בארות בזהירות שכבה נוספת 25 מיליליטר של מדיה הרחבה ל הבאר. ואז להידגר התאים באין מפריע ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים.
כדי לאסוף את התאים מן בארות, להסיר ולהשליך 20 מיליליטר של התקשורת דואג לא להפריע לתאים. פיפטה המדיה הנותרת למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. השתמש פיפטה העברה סטרילית לשטוף כל באר עם שלושה מיליליטר של מדיה ולאסוף את התאים שיורית.
לאחר מכן ספור אותם כדי לבדוק אם קיימים מספר תא וכדאיות. פרוטוקול זה שימש להעתקה והרחבה של תאים משש חיות שונות. בארות חדירות גז נזרעו בצפיפות התחלתית של חמישה מיליון תאים ולאחר ארבעה ימים של צמיחה, הושגה צפיפות חציונית של 55.6 מיליון תאים ל באר.
הכדאיות של התאים המנוטרים על ידי אי הכללה כחולה trypan נשמרה ב 83 עד 95% לאורך כל הפרוטוקול. ציטומטריית זרימה שימשה להתבוננות בביטוי שותף של הגנים שהתומרו. ביום החמישי, חציון של 42.8% מהתאים הותמר הן עם CD4-MBL CAR והן עם CXCR5.
בעוד שביום התשיעי, הביטוי החציוני היה 47.6% עם סבב יחיד של ההעתקה. ציטומטריית זרימה שימשה גם לניטור פנוטיפ זיכרון. לפני התמורה וההתפשטות זוהו אוכלוסיות זיכרון מרכזיות נאיביות וזיכרון משפיע.
האוכלוסייה הנאיבית אבדה עם culturing והתאים היו בעיקר תאי זיכרון מרכזיים ביום החמישי והיום התשיעי. ההצלחה בהעתקה תלויה בשימוש בריאגנטים באיכות גבוהה, תאים בני קיימא מאוד ווירוסים ציטרציה, כמו גם באופן עקבי בעקבות העיתוי של הפרוטוקול. התאים יכולים לשמש עבור בדיקות תפקודיות כולל הגירה ודיכוי ויראלי בדיקות, כמו גם עירוי לתוך בעלי חיים למחקרים פרה-קליניים כדי לבדוק את היעילות של האימונותרפיה.
התקדמנו עם בדיקות פרה-קליניות של תאי T CAR ו- CXCR5 בבעלי חיים ומקווים לבדוק בקרוב את האימונותרפיה הזו אצל אנשים נגועים ב- HIV.
