We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Protocolos para todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal no Centro de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. colheita mouse Thymus para Preparação de tímicos Slices e suspensões de células individuais <ol><li> Eutanásia do rato com CO 2, seguida por deslocação cervical. </li><li> Em uma capela de fluxo laminar, pin lado o rato ventral-se a uma placa de dissecação. Pulverizar o rato com 70% de etanol. Remova qualquer excesso de álcool, esfregando com uma gaze para evitar que o etanol de entrar na cavidade torácica e danificar o tecido. </li><li> Levantar a pele na base do esterno com um par de pinças e fazer um corte através da pele. Estender o corte da pele para cima para cada membro anterior. </li><li> Fazer um corte adicional na base do esterno para separar o diafragma da caixa torácica. Em seguida, corte cada lado da caixa torácica para a clavícula. Virar a caixa torácica na direção da cabeça expondo a cavidade torácica. Os dois lóbuloso timo se encontram na parte superior do coração. </li><li> Remover o tecido conjuntivo em torno dos lobos do timo usando uma pinça, tesoura micro-dissecação, e / ou tesoura curva afiadas. Use um par de ponta curvada uma pinça fina para levantar os lobos individuais por baixo ou através do restante do tecido conjuntivo. Nota: Não segure o timo diretamente. </li><li> Coloque os lóbulos do timo em um tubo cônico de 15 ml contendo PBS e reserve em gelo até ser necessário. </li></ol> 2. Agarose Embedding e Vibratome Corte do timo Lobes <ol><li> Preparar a solução de agarose a 4% para a incorporação dissolvendo 2 g de baixo ponto de fusão de agarose em 50 ml estéril PBS e microondas em um nível baixo até que a agarose se dissolva completamente. Cubra balão com folha de alumínio e coloque num banho de água a 55 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Num capuz de cultura de tecidos, preparar meio completo RPMI-1640 que contém soro fetal de bovino 10% (FBS), L-glutamina 4 mM, 1x penicilina / estreptomicina, e 10 uM2-mercaptoetanol. </li><li> Adicionar 1,5 ml de meio RPMI-1640 completo por poço para uma placa de cultura celular de 6 poços e colocar uma inserção de cultura de células em cada poço. Definir o prato de lado numa incubadora a 37 ° C até ser necessário. </li><li> Prepare um banho de água gelada lamacenta com água e gelo em um balde de gelo. </li><li> Remova cuidadosamente todo o tecido conjuntivo permanecendo em torno de cada lóbulo do timo usando uma pinça de ponta fina. Fazer isto enquanto o lóbulo tímico é submersa em PBS numa placa de cultura de tecidos, depois de transferência para um lenço de papel embebido com PBS, ou sob um microscópio de dissecação. </li><li> Permitir que a agarose arrefecer abaixo de 40 ° C, quando o balão é apenas a quente ao toque, para evitar o sobreaquecimento do tecido. Verter a arrefeceu-se 4% de agarose para um molde de tecido a uma altura de 1 cm ~. </li><li> Use um par de fórceps para transferir cuidadosamente o lobo do timo a um lenço de papel e enrole-o delicadamente para secá-lo sem danificar o tecido. Certifique-se de que o tecido seque completamente ou ele vai deslizar para fora da agarose durante cortando. </li><li> Cuidadosamente inserir o lóbulo em que a agarose e posicioná-lo horizontalmente, quer (para aumentar a área de superfície de cada fatia) ou verticalmente (para aumentar o número de fatias), na parte inferior do molde. Coloque o molde em água de gelo durante 5-10 minutos para permitir que a agarose solidificar. </li><li> Durante este tempo, preparar vibratome para cortar através da montagem de tabuleiro de tampão, a montagem do disco de amostra, e inserir a lâmina vibratome. Coloque um pedaço de fita de laboratório sobre o disco de amostra. Esterilizar o espaço de trabalho limpo, montado com 70% de etanol. </li><li> Uma vez que os solidifica de agarose, inverter o molde e pressione suavemente em seu centro para liberar a agarose incorporado lóbulo. </li><li> Usar uma lâmina afiada para cortar o excesso de agarose em torno do lóbulo deixando ~ 2 mm de agarose em cada lado e ~ 0,5 cm na parte inferior. </li><li> Fixe cada bloco de agarose com uma gota de cola de tecido para o pedaço de fita adesiva no disco de amostra. Vários blocos podem ser colados na fita. </li><li> Alinhe o wi lâmina vibratomepo do topo do bloco de agarose. Encha a bandeja de tampão com PBS estéril até que o bloco (s) de lâmina e agarose são totalmente imersos. </li><li> Secção do tecido de agarose incorporado para obter fatias com uma espessura de 400-500 um. Defina o vibratome a 0,225 mm / seg de velocidade, freqüência de 100 Hz e 5 ° ângulo. </li><li> Usar uma espátula dobrada para recolher as fatias do timo em uma placa de cultura de tecido contendo PBS estéril à medida que são cortadas. Rejeitar a primeira e última fatia. </li><li> Examine as fatias sob um microscópio de luz em uma ampliação de 4X. Escolha as fatias com tecido tímico intacta e em torno de agarose (Figura 1A). </li><li> Transferir as fatias para a placa, preparado no passo 2.3, utilizando uma ponta de pipeta para deslizar suavemente a fatia timo da espátula dobrada sobre a inserção de cultura de célula. Cada inserção pode acomodar ~ 3 fatias. Certifique-se as fatias não se tocam ou as paredes da inserção de cultura de células. </li><li> Manter a placa a 37 ° C até ser necessário. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparação de timócitos para sobrepor <ol><li> Isolar lóbulos do timo, tal como descrito na secção 1. dissociar os lóbulos manualmente para fazer uma suspensão de células individuais utilizando um triturador de tecido de 15 ml esterilizado cheia com 5 ml de PBS estéril contendo 2% de FBS. Transferir as células para um tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de tampão de lise 1x ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA) à temperatura ambiente durante 3 min para lisar as células vermelhas do sangue. </li><li> Encher o tubo para 15 ml com PBS contendo 2% de FBS. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em 10 ml de PBS contendo 2% de FBS e passar as células através de um filtro de malha de 255? M. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender a pelete de células em PBS contendo 2% de FBS, para uma concentrção de 1 x 10 7 células por ml. </li><li> Marcar as células com corantes celulares, tais como o éster de succinimidilo carboxifluoresceína (CFSE) de acordo com os protocolos do fabricante, se não utilizando timócitos de ratinhos que expressam marcadores congï¿½icas ou repórteres fluorescentes geneticamente codificados para distinguir a partir de células endógenas fatia. </li><li> Após a lavagem final das células marcadas, ressuspender o sedimento de células em meio RPMI-1640 completo a 1-3 x 10 6 culas por 15 ul. </li></ol> 4. Sobreposição de timócitos para o timo Slices <ol><li> Usar uma pipeta para aspirar qualquer líquido que rodeia as fatias do timo sobre a inserção. Nota: Tome cuidado para não danificar a agarose. Se a agarose é danificado, os timócitos sobrepostas não irá aderir à superfície da fatia devido a perda da tensão de superfície. </li><li> Sem tocar na fatia com a ponta da pipeta, sobreposição de 15 ul de timócitos preparados na seção 3 para cada fatia do timo. </li><li> Incubar as plate a 37 ° C durante 2 horas para permitir que as células migrem para as fatias do timo. </li><li> Após 2 h, lavar as fatias do timo 3 vezes com 1 ml de PBS para remover o excesso de timócitos sobrepostas que ainda não migraram para o tecido. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C até que as fatias do timo estão prontas para ser colhidas, tipicamente 1-72 horas, dependendo da experiência. </li></ol> 5. A dissociação de tímicos Slices para citometria de fluxo <ol><li> Preparar um tubo de microcentrífuga para cada fatia através da adição de 150 uL de PBS contendo 2% de FBS. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS contendo 2% FBS para a inserção de cultura de tecido com as fatias do timo e agitar suavemente com uma espátula dobrada para separar as fatias a partir da superfície da inserção de cultura de célula. </li><li> Transferir a fatia a partir da inserção para o tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula dobrada. </li><li> interromper manualmente a fatia usando um pilão microcentrifuge amostra de tubo. Adicionar 150 uL de PBS contendo 2% de FBS para um volume final de 300ul. </li><li> Filtra-se o tecido dissociado através de um filtro de 40 um para um novo tubo de microcentrifugação. As células filtradas está pronto para ser corada para análise de citometria de fluxo 40. </li><li> Filtrar as células uma segunda vez antes de passá-los num citómetro de fluxo para garantir que toda a agarose é removida e não entupir o citómetro de fluxo. </li><li> Adquirir as células num citómetro de fluxo e análise de dados, como foi anteriormente descrito 40. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de fatias do timo e resultados representativos de selecção positiva e negativa eficiente da pré-selecção do coberto MHC classe restrita-I TCR timócitos transgênicas por citometria de fluxo. Este sistema tem sido utilizado com sucesso similar para suportar a selecção positiva de células MHC de classe II restringidas CD4 + T a partir de pré-selecção DP timócitos 32, e, na presença do antigénio com o agonista, a selecção negativa...

As células T diferenciam por meio de uma série de intermediários de desenvolvimento no timo durante o qual eles encontram vários pontos de controlo que asseguram a geração de, um repertório de células T auto-tolerante funcional 1-3. A selecção positiva promove a sobrevivência dos timócitos com receptores de células T (TCR), capazes de reconhecer, com baixa a moderada afinidade, péptido apresentados por moléculas de grandes complexos de histocompatibilidade (MHC) sobre as células epiteliais tímicas corticais (2,3 CTEC). Selecção negativa e desenvolvimento de células T reguladoras (T reg) contribuir para o estabelecimento da auto-tolerância através da eliminação ou desvio de timócitos que respondem fortemente a auto-peptídeo apresentado por MHC 2,4. Imaturos CD4 + CD8 + positivas dupla (DP) timócitos expressando TCRs que passam o processo de selecção diferenciam em subpopulações de células T maduras, a maioria dos quais são de classe I-restringida de MHC de células CD8 + citotóxicasou MHC de classe II restrito de células T CD4 + auxiliares individuais positivas (SP), antes de sair do timo para realizar as funções efectoras nos órgãos linfóides secundários 1-3. Adicionando à complexidade do desenvolvimento de células T é a migração dinâmica e encontros celulares do desenvolvimento de timócitos em toda a rede celular de estroma 5-9. Estas células estromais desempenham papéis distintos no desenvolvimento de timócitos e são diferencialmente distribuídos entre as regiões corticais e medulares do timo, onde positivo e seleção negativa ocorrem 10. Embora a selecção positiva ocorre principalmente no córtex, não há acumulação de provas de que os timócitos DP migrar para a medula e continuar a exigir que os sinais de TCR, antes de se diferenciar em células T maduras, sugerindo que a medula pode fornecer sinais adicionais necessários para a realização de selecção positiva e linhagem 11,12 diferenciação. Mais distante,apesar da presença de células especializadas medulares do timo epiteliais (MTEC) que expressam e apresentam antigénios restrita a um tecido que facilitem a eliminação de timócitos autorreactivas 13,14, uma grande proporção de selecção negativa ocorre no córtex em resposta a expresso ubiquamente auto-péptido apresentado por dendrítica células 15,16. Assim, modelos precisos de desenvolvimento de células T deve proporcionar um microambiente tímico altamente organizada, com cortical intacta e regiões medulares, que facilita a interacção entre timócitos e células do estroma, e suporta a migração de timócitos como estas células sofrem de selecção positiva e negativa. Para complementar ex vivo análises de timócitos como um meio de estudar a selecção positiva e negativa, um certo número de ensaios in vitro, in situ, e em modelos in vivo do desenvolvimento de células T têm sido desenvolvidos 17-22. Tem sido notoriamente difícil de recapitulara selecção positiva, in vitro, mas co-cultura de populações de células estaminais ou precursores de células T com células estromais que expressam ligando de Notch, nomeadamente OP9-DL1 / 4 células, tem a capacidade de suportar compromisso linhagem T e selecção positivo reduzido tornando-se um valor inestimável modelo in vitro para desenvolvimento de células T estudo 23-25. As limitações deste sistema, no entanto, incluem o facto de estas células não possuem a maquinaria de processamento de péptidos única encontrada nas células do estroma de timo e o microambiente tímico tridimensional. Embora tecnicamente mais complicada, in situ e in vivo em modelos de selecção tímica pode superar alguns dos obstáculos relacionados com os sistemas in vitro. Culturas de órgãos tímicos Reaggregate (RTOC) contêm misturas de timócitos e de células do estroma de timo 18,26,27 definido. Estas células epiteliais tímicas reaggregates manter a MHC de classe I e II de expressão e pode suportar development de ambos os subconjuntos de células T convencionais, mas ainda não têm definido estruturas corticais e medulares. Fetal cultura de órgão tímico (FTOC) é um modelo popular de desenvolvimento de células T que pode ser semeada com timócitos via cultura de suspensão-gota de lóbulos do timo lymphodepleted ou por meio de injecção de timócitos em lymphoreplete lóbulos do timo e apoiar o desenvolvimento eficiente de células T CD4 + e CD8 + T células ao longo do tempo na cultura 18,28-31. No início da cultura de lobos do timo fetal há uma escassez de mTECs, mas as estruturas corticais e medulares definidos podem desenvolver ao longo do tempo, dependendo das condições. Uma consideração importante é que este modelo pode preferencialmente suportar fetal contra o desenvolvimento de células T do adulto. Finalmente, injeção intratímico de precursores do timo definidos em camundongos adultos é tecnicamente desafiador, mas claramente fornece um ambiente para apoiar Desenvolvimento de células T in vivo. Estes in situ e em modelos in vivo são excelentes ferramentas to desenvolvimento de células T estudo ea sua utilização deve ser considerada a título experimental de-by-experimento. Fatias do timo, no entanto, surgiram recentemente como um modelo versátil, complementares para estudar a seleção do timo in situ com a possibilidade de acomodar única, complexa e experimentos de taxa de transferência, geralmente mais elevados. Fatias do timo manter a integridade das regiões corticais e medulares e fornecer um quadro de células estromais que suporta a migração de timócitos durante o desenvolvimento, bem como eficiente selecção positiva e negativa 11,32-39. Subconjuntos de timócitos adicionados no topo de fatias do timo migram para o tecido e seu nicho microambiental adequada 34,37. Os timócitos sobrepostas podem ser distinguidas das células endógenas fatia de timo através de marcadores congï¿½icas ou marcadores fluorescentes e podem ser mantidas em cultura durante vários dias. culturas organotípicas fatia do timo pode ser utilizado para estudar vários aspectosdo desenvolvimento de células T, incluindo selecção tímica, o comportamento de timócitos (migração e interacções celulares), e localização de timócitos, entre outros. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias do timo por ratinho, a escalabilidade das experiências é geralmente maior do que o outro em modelos in situ de selecção tímica. Embora a preparação de fatias do timo requer equipamento especializado, tal como o vibratome, e o tempo de vida de fatias do timo em cultura é limitada devido à perda de células ao longo do tempo através de morte celular e a ausência de uma membrana de encapsulação, as fatias do timo fornecer um excelente modelo por análise de selecção tímica de populações sincronizadas de timócitos dentro de um microambiente tímico madura. Aqui, descrevemos a preparação de fatias do timo, incluindo a colheita (o timo, a incorporação de agarose de lóbulos do timo e vibratome seccionamento do tecido embebido), isolamento e revestimento dos timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50080</td><td>Low melting temperature agarose</td></tr><tr><td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td><td>Polyciences</td><td>18986</td><td>22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Double Edge Prep Blades</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>3M&amp;nbsp;</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;micro;m Cell Culture Inserts&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 with L-glutamine</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Wisent</td><td>080-110</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 200 mM</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Filter</td><td>Component Supply</td><td>U-CMN-255</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td><td>Bel-Art</td><td>F19922-0000</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Nylon Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Inox Tip</td><td>Dumont&amp;nbsp;</td><td>RS-5047</td><td>Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm</td></tr><tr><td>Micro Forceps</td><td>Dumont&amp;nbsp;</td><td>RS-5090&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

Seleção rendimentos do timo em um microambiente tímico única e altamente organizada resultando na geração de um repertório de células T funcional, auto-tolerante. Modelos in vitro para estudar o compromisso linhagem T e desenvolvimento forneceram informações valiosas sobre este processo. No entanto, estes sistemas têm a meio do timo tridimensional completa necessária para o desenvolvimento da célula T e, por conseguinte, são aproximações incompletos in vivo de selecção tímica. Alguns dos desafios relacionados com o desenvolvimento de células T de modelagem pode ser superado usando em modelos in situ que fornecem um microambiente tímico intacta que apoia plenamente a seleção do timo de desenvolvimento de células T. Timo culturas fatia organotípicas complementar as técnicas in situ. fatias tímicos preservar a integridade das regiões corticais e medulares do timo e oferecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento de timócitos sobrepostas de um estágio de desenvolvimento definidas ou de endógena T cells dentro de um microambiente tímico maduro. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias por rato, fatias do timo apresentar uma vantagem única em termos de escalabilidade para experimentos de alto rendimento. Além disso, a relativa facilidade na geração de fatias do timo e potencial para sobrepor diferentes subconjuntos de timo ou de outras populações de células de diversas origens genéticas aumenta a versatilidade do presente método. Descrevemos aqui um protocolo para a preparação de fatias do timo, o isolamento e a sobreposição de timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo. Este sistema também pode ser adaptado para estudar o desenvolvimento de células T não-convencionais, bem como visualizar a migração de timócitos, as interacções das células de timócitos-estromal, e sinais associados com TCR selecção tímica por microscopia de dois fotões.

análise de suporte fatias do timo dos diferentes aspectos do desenvolvimento de células T, tais como selecção positiva e negativa. Para as experiências bem sucedidas, a qualidade da fatia tímico é primordial. Deste modo, as fatias do timo deve ser examinado para assegurar a integridade do tecido tímico e que a agarose em torno do timo fatia está intacto (Figura 1A). A tensão superficial pode ser comprometida quando a agarose é danificado cau...

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Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K visualizações.  Hôpital Maisonneuve-Rosemont.  Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões. 

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Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Biologia do Desenvolvimento

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Neurociência

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Pesquisa do câncer

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biologia

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Imunologia e Infecção

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...