Este protocolo investiga as propriedades mecânicas biaxiais dos órgãos reprodutivos que elucidam a contribuição das células musculares lisas e da matriz passiva. Esta técnica mantém a geometria dos órgãos e a célula muscular lisa nativa para interações matriciais permitindo a sujeição do órgão a uma gama fisiológica de pressões e extensões axiais. Investigar a função biaxial do órgão sob cargas fisiologicamente relevantes pode auxiliar na melhor compreensão da etiologia das patologias reprodutivas.
Testar biaxalmente o colo uterino e a vagina fornece uma visão dos campos da saúde da mulher e da biomecânica. Métodos semelhantes são utilizados para estudar vasos sanguíneos, esôfago e intestinos grossos. Ao trabalhar com um novo órgão, pode levar tempo para finalizar os detalhes técnicos, como como melhor suturar o tecido ou como determinar o comprimento descarregado.
Para coletar o sistema reprodutivo do animal experimental, coloque o rato em uma almofada absorvente sob um microscópio dissecando e use pinças angulares e tesouras para levantar a pele ao redor do abdômen. Faça uma incisão inicial na base do abdômen acima do osso púbico raso o suficiente para não perfurar a parede muscular abdominal e continuar a incisão superiormente em direção à caixa torácica e profundamente através dos músculos abdominais. Depois de remover a gordura superficial e cortar cuidadosamente a sífise púbica, use pinças retas para agarrar a bexiga para criar tensão e usar dissecção contundente para separar o tecido circundante da vagina.
Em seguida, corte a base do sistema reprodutivo para remover os tecidos da cavidade corporal. Depois de determinar o tamanho adequado da cânula para o sistema colhido, monte o lado cervical na porção transdutor de força do dispositivo de cannula e monte a extremidade oposta do órgão na porção de micrômetro do dispositivo. Em seguida, aperte ambas as extremidades com suturas.
Para encontrar o comprimento descarregado do tecido montado, primeiro estique o órgão para que a parede não esteja em tensão. Para a vagina, observe as ranhuras na parede vaginal. Para o colo do útero, corte imediatamente abaixo dos pontos de tinta localizados acima e abaixo da marca do colo do útero central.
Use pinças para medir o comprimento do sistema da sutura à sutura e aumentar a pressão do sistema de miógrafo de zero a 10 milímetros de mercúrio em um milímetro de incrementos de mercúrio. A pressão em que o órgão não está mais colapsado pode ser determinada como o maior salto no diâmetro externo a uma determinada pressão. Após o registro da pressão e do diâmetro externo, observe esses dados como o primeiro ponto em que o órgão não está colapsado e zerar a força.
Para encontrar o trecho in vivo experimental, ajuste o órgão ao comprimento in vivo estimado enquanto estiver na pressão descarregada e clique para avaliar os valores de pressão versus força para os valores de pressão que vão desde a pressão descarregada até a pressão máxima. Em seguida, clique em parar e salvar o arquivo. Para pré-condicionamento de diâmetro de pressão, coloque a pressão a zero milímetros de mercúrio, o comprimento até o comprimento experimental in vivo, e o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo.
Execute uma sequência que leva a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima mais a pressão descarregada, segure por 30 segundos e retorne a zero milímetros de mercúrio com um período adicional de 30 segundos de espera. Depois de repetir esta sequência para um total de cinco ciclos, clique em parar e salvar o arquivo. Para o pré-condicionamento do comprimento da força, digite 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada tanto para as pressões de entrada quanto para saída e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo.
Clique em iniciar e ajustar o comprimento para mais 2% de comprimento in vivo e volte para menos 2% a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Repita a extensão axial para um total de cinco ciclos antes de clicar em parar e salvar o arquivo. Para o teste de diâmetro de pressão do comprimento in vivo, clique em iniciar e ajustar o órgão ao comprimento in vivo, ajuste a pressão para zero milímetros de mercúrio e ajuste o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo.
Aumente a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima antes de reduzir a pressão para zero milímetros de mercúrio com um período de ressartura de 20 segundos. Em seguida, repita o teste por cinco ciclos antes de parar o sistema e salvar os dados. Para o teste de comprimento de força de 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada, ajuste a pressão para 1/3 da pressão máxima mais a pressão descarregada e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo.
Após o início do clique, estique o órgão para mais 2% do comprimento in vivo e volte para menos 2% do comprimento in vivo a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Em seguida, repita o teste para um total de três ciclos antes de parar o sistema e salvar os dados. Após o último teste, remova o meio de teste KRB e lave o órgão com meio KRB livre de cálcio.
Após a lavagem, incubar o órgão com uma solução KRB fresca sem cálcio complementada com dois EGTA milimôlares por 30 minutos antes de substituir a solução de tratamento por KRB fresco sem cálcio. Na conclusão do teste do tom basal, para pré-condicionamento de diâmetro de pressão, clique no início e defina a pressão a zero milímetros de mercúrio, o comprimento como o comprimento in vivo estimado, e o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio por segundo. Comece a executar uma sequência que leva a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima e de volta a zero milímetros de mercúrio.
Repita este processo através de cinco ciclos com um tempo de espera de 30 segundos. Para o pré-condicionamento do comprimento da força, ajuste o órgão ao comprimento in vivo e digite manualmente a pressão descarregada para ambas as pressões. Clique em iniciar e definir o gradiente para 1,5 milímetros de mercúrio e a pressão para 1/3 do máximo.
Estique o órgão até mais 2% e recue até menos 2% de estiramento a 10 micrômetros por segundo e repita o ciclo por um total de cinco vezes. Para testes de diâmetro de pressão, com o órgão a menos 2% do comprimento in vivo experimentalmente determinado e a pressão a zero milímetros de mercúrio, clique em iniciar e aumentar a pressão de zero milímetros de mercúrio para a pressão máxima e volte para zero milímetros de mercúrio. Segure os zero milímetros de mercúrio passo por 20 segundos e repita o ciclo cinco vezes.
Para o teste de comprimento de força, ajuste a pressão em uma pressão nominal e ajuste o órgão para menos 2% do comprimento in vivo. Estique o órgão até mais 2% do comprimento in vivo e volte para menos 2% do comprimento in vivo a uma taxa de 10 micrômetros por segundo. Após um total de três ciclos, salve os dados e repita o teste de comprimento de força para 1/3 da pressão máxima, 2/3 da pressão máxima e na pressão máxima.
Para uma análise bem sucedida das propriedades mecânicas dos órgãos reprodutivos femininos, é imperativo explantar os chifres uterinos para a vagina sem defeitos. Dependendo do tipo de órgão, o tamanho da cânula vai variar. A canulação deve ser realizada para que o órgão não possa se mover durante o experimento, mas sem danificar a parede do órgão durante o procedimento.
O sistema de miógrafo de pressão pode ser usado para monitorar vários aspectos do órgão, pois ele passa por testes mecânicos e o sistema de ultrassom pode ser usado para medir a espessura dos órgãos no estado descarregado com e sem tom basal. Após testes mecânicos, o moduli tangente pode ser calculado para as direções circunferenciais e axiais. Tanto o teste de tom basal quanto os testes passivos produzem propriedades mecânicas fundamentais do trato reprodutivo com e sem a contribuição contratil das células musculares lisas.
O dimensionamento entre os órgãos requer alguns ajustes nos protocolos, pois o colo uterino e a vagina experimentam diferentes cargas in vivo. É fundamental realizar a dissecção rapidamente para manter a viabilidade das células musculares lisas, mas cuidadosamente para não perfurar o órgão desejado. Experimentos de ângulo de abertura que medem a cepa residual do órgão podem ser realizados após procedimentos de teste mecânico, bem como vários ensaios histológicos e bioquímicos.
Após seu desenvolvimento e investigação da contribuição basal de células musculares lisas, esta técnica também permite avaliar a resposta contratil máxima do músculo liso do sistema reprodutivo sob cargas fisiologicamente relevantes.
