Este protocolo investiga las propiedades mecánicas biaxiales de los órganos reproductivos que aclaran la contribución de las células musculares lisas y la matriz pasiva. Esta técnica mantiene la geometría del órgano y las interacciones nativas de la célula muscular lisa a la matriz permitiendo la sujeción del órgano a un rango fisiológico de presiones y extensiones axiales. La investigación de la función biaxial del órgano bajo cargas fisiológicamente relevantes puede ayudar a comprender mejor la etiología de las patologías reproductivas.
Las pruebas biaxiales del cuello uterino y la vagina proporcionan información sobre los campos de la salud de las mujeres y la biomecánica. Métodos similares se utilizan para estudiar los vasos sanguíneos, el esófago y el intestino grueso. Cuando se trabaja con un nuevo órgano, puede tomar tiempo para finalizar los detalles técnicos tales como cómo suturar mejor el tejido o cómo determinar la longitud descargada.
Para recoger el sistema reproductivo del animal experimental, coloque el ratón sobre una almohadilla absorbente bajo un microscopio diseccionante y utilice pinzas y tijeras en ángulo para levantar la piel alrededor del abdomen. Haga una incisión inicial en la base del abdomen por encima del hueso púbico lo suficientemente superficial como para no perforar la pared muscular abdominal y continuar la incisión superiormente hacia la caja torácica y profundamente a través de los músculos abdominales. Después de eliminar la grasa superficial y cortar cuidadosamente la sínfisis púbica, utilice pinzas rectas para agarrar la vejiga para crear tensión y utilizar la disección contundente para separar el tejido circundante de la vagina.
Luego corte la base del sistema reproductivo para eliminar los tejidos de la cavidad corporal. Después de determinar la cánula de tamaño adecuado para el sistema cosechado, monte el lado cervical en la porción del transductor de fuerza del dispositivo de canulación y monte el extremo opuesto del órgano en la porción del micrómetro del dispositivo. A continuación, apriete ambos extremos con suturas.
Para encontrar la longitud descargada del tejido montado, primero estire el órgano para que la pared no esté en tensión. Para la vagina, observe los surcos en la pared vaginal. Para el cuello uterino, corte inmediatamente debajo de los puntos de tinta situados por encima y por debajo de la marca central del cuello uterino.
Utilice pinzas para medir la longitud del sistema desde la sutura hasta la sutura y aumentar la presión del sistema de miografía de cero a 10 milímetros de mercurio en un milímetro de incrementos de mercurio. La presión en la que el órgano ya no está colapsado se puede determinar como el salto más grande en el diámetro exterior a una presión dada. Después de registrar la presión y el diámetro exterior, observe estos datos como el primer punto en el que el órgano no se contrae y cero la fuerza.
Para encontrar el estiramiento in vivo experimental, ajuste el órgano a la longitud in vivo estimada mientras que a la presión descargada y haga clic en comenzar para evaluar los valores de presión frente a fuerza para los valores de presión que van desde la presión descargada hasta la presión máxima. A continuación, haga clic en detener y guarde el archivo. Para el preacondicionamiento del diámetro de presión, ajuste la presión a cero milímetros de mercurio, la longitud a la longitud in vivo experimental y el gradiente a 1,5 milímetros de mercurio por segundo.
Ejecute una secuencia que lleve la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima más la presión descargada, mantenga durante 30 segundos y vuelva a cero milímetros de mercurio con un período de retención adicional de 30 segundos. Después de repetir esta secuencia para un total de cinco ciclos, haga clic en Detener y guarde el archivo. Para el preacondicionamiento de la longitud de fuerza, introduzca 1/3 de la presión máxima más la presión descargada para las presiones de entrada y salida y ajuste el órgano a menos 2% de la longitud in vivo.
Haga clic en Inicio y ajuste la longitud a más 2% de longitud in vivo y vuelva a menos 2% a una velocidad de 10 micrómetros por segundo. Repita la extensión axial para un total de cinco ciclos antes de hacer clic en Detener y guardar el archivo. Para las pruebas de diámetro de presión de la longitud in vivo, haga clic en iniciar y ajustar el órgano a la longitud in vivo, establezca la presión en cero milímetros de mercurio y establezca el gradiente en 1,5 milímetros de mercurio por segundo.
Aumente la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima antes de reducir la presión a cero milímetros de mercurio con un período de retención de 20 segundos. A continuación, repita la prueba durante cinco ciclos antes de detener el sistema y guardar los datos. Para la prueba de longitud de fuerza de 1/3 de la presión máxima más la presión descargada, ajuste la presión a 1/3 de la presión máxima más la presión descargada y ajuste el órgano a menos 2% de la longitud in vivo.
Después de hacer clic en inicio, estire el órgano a más 2% de la longitud in vivo y de nuevo a menos 2% de la longitud in vivo a una velocidad de 10 micrómetros por segundo. A continuación, repita la prueba para un total de tres ciclos antes de detener el sistema y guardar los datos. Después de la última prueba, retire el medio de prueba KRB y lave el órgano con un medio KRB libre de calcio.
Después del lavado, incubar el órgano con una solución KRB fresca sin calcio complementada con dos EGTA milimétricas durante 30 minutos antes de sustituir la solución de tratamiento por KRB fresco libre de calcio. Al finalizar la prueba de tono basal, para el preacondicionamiento del diámetro de presión, haga clic en iniciar y establezca la presión en cero milímetros de mercurio, la longitud como la longitud in vivo estimada y el gradiente a 1,5 milímetros de mercurio por segundo. Comience a ejecutar una secuencia que lleve la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima y de vuelta a cero milímetros de mercurio.
Repita este proceso a través de cinco ciclos con un tiempo de espera de 30 segundos. Para el preacondicionamiento de la longitud de fuerza, ajuste el órgano a la longitud in vivo e introduzca manualmente la presión descargada para ambas presiones. Haga clic en Inicio y establezca el gradiente en 1,5 milímetros de mercurio y la presión en 1/3 del máximo.
Estirar el órgano hasta más 2% y volver a menos 2% estirar a 10 micrómetros por segundo y repetir el ciclo para un total de cinco veces. Para las pruebas de diámetro de presión, con el órgano en menos 2% de la longitud in vivo determinada experimentalmente y la presión a cero milímetros de mercurio, haga clic en iniciar y aumentar la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima y de vuelta a cero milímetros de mercurio. Mantenga los cero milímetros del paso de mercurio durante 20 segundos y repita el ciclo cinco veces.
Para las pruebas de longitud de fuerza, ajuste la presión a una presión nominal y ajuste el órgano a menos 2% de la longitud in vivo. Estirar el órgano hasta más el 2% de la longitud in vivo y volver a menos 2% de la longitud in vivo a una velocidad de 10 micrómetros por segundo. Después de un total de tres ciclos, guarde los datos y repita la prueba de longitud de fuerza para 1/3 de la presión máxima, 2/3 de la presión máxima y a la presión máxima.
Para un análisis exitoso de las propiedades mecánicas de los órganos reproductivos femeninos, es imperativo explanar los cuernos uterinos a la vagina sin ningún defecto. Dependiendo del tipo de órgano, el tamaño de la cánula variará. La cannulación debe realizarse para que el órgano no pueda moverse durante el experimento, pero sin dañar la pared del órgano durante el procedimiento.
El sistema de miógrafo de presión se puede utilizar para monitorear varios aspectos del órgano, ya que se somete a pruebas mecánicas y el sistema de ultrasonido se puede utilizar para medir el grosor de los órganos en estado descargado con y sin tono basal. Después de las pruebas mecánicas, los módulos tangentes pueden calcularse para las direcciones circunferenciales y axiales. Tanto las pruebas de tono basal como las pruebas pasivas producen propiedades mecánicas clave del tracto reproductivo con y sin la contribución contráctil de las células musculares lisas.
La escala entre los órganos requiere algunos ajustes en los protocolos, ya que el cuello uterino y la vagina experimentan diferentes cargas in vivo. Es clave realizar la disección rápidamente para mantener la viabilidad de las células musculares lisas, pero cuidadosamente no perforar el órgano deseado. Los experimentos de ángulo de apertura que miden la tensión residual del órgano se pueden realizar después de los procedimientos de prueba mecánica, así como varios ensayos histológicos y bioquímicos.
Después de su desarrollo e investigación de la contribución basal de la célula muscular lisa, esta técnica también permite evaluar la máxima respuesta contráctil del músculo reproductivo bajo cargas fisiológicamente relevantes.
