A superexpressão de genes nas células é uma maneira importante de estudar a função genética. Transfecção estável com o retrovírus permite que genes endógenos sejam integrados ao genoma hospedeiro e sejam expressos continuamente. Pegamos colônias únicas da infecção retroviral e geramos linhas de células estáveis superexpressando DR3 com marca de BANDEIRA.
As linhas celulares compensaram a indisponibilidade de um bom anticorpo DR3 e forneceram excelentes ferramentas para o estudo da função DR3 pós in vitro e in vivo. Geramos as linhas de células de superexpressão DR3 captando uma única colônia da infecção retroviral. Linhas celulares de uma única colônia poderiam manter a homogeneidade e pureza.
Além disso, o protocolo é fácil e simples de manusear. Para iniciar este procedimento, cresça células plat-A durante a noite em pratos de 60 milímetros com quatro mililitros de DMEM. Quando as células atingem 80 a 90% de confluência, use reagente de transfecção para transfetá-las com dois microgramas do plasmídeo construído, conforme descrito no manual do fabricante.
Depois de 72 horas, pegue o supernaspe. Usando um filtro estéril de 0,45 micrômetro, filtre a mídia e mantenha a suspensão viral no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, cultivar células HT29 durante a noite em um prato de 60 milímetros com DMEM, incubando as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Quando as células atingem 30 a 50% de confluência, infecte-as com dois mililitros de suspensão viral na presença de oito microgramas de polibreno por mililitro de suspensão viral. Incubar as células infectadas a 37 graus Celsius por quatro a seis horas. Então, aspirar a suspensão viral.
Adicione quatro mililitros de DMEM frescos e devolva o prato para a incubadora. Às 24 horas após a infecção, remova a mídia dos pratos e lave cuidadosamente as células com dois mililitros de PBS pré-aquecidos. Adicione um mililitro de trippsina EDTA, e incuba as células a 37 graus Celsius por três minutos.
Usando um microscópio a 10 vezes a ampliação, observe as células para garantir que a maioria delas tenha se destacado. Depois disso, adicione dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS para parar a trippsinização e colete a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente, e remover o supernatante.
Suspenda a pelota da célula em 10 mililitros de DMEM e aplique suavemente para cima e para baixo para misturar. Em seguida, diluir as células por fatores de 30, 100 e 300. Sementes as células são pratos de 150 milímetros que cada um contém 20 mililitros de DMEM contendo blasticidina a uma concentração de um micrograma por mililitro.
Incubar a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por aproximadamente uma a duas semanas. Durante esse período, use um microscópio invertido a 10 vezes a ampliação para observar as colônias todos os dias. Marque as colônias bem isoladas na parte inferior do prato quando o diâmetro das colônias é de aproximadamente um a dois milímetros.
Quando o período de incubação estiver completo, aspire o meio e lave as células com três mililitros de PBS pré-aquecidos. Adicione dois mililitros de trippsina EDTA em um prato de 60 milímetros. Use fórceps estéreis para pegar cilindros de clonagem estéril autoclavados e colocá-los no prato.
Em seguida, pegue os cilindros que agora contêm aproximadamente 30 microliters de trypsin EDTA, e coloque-os suavemente sobre as colônias marcadas. Devolva o prato para a incubadora por três minutos. Depois disso, verifique as células sob um microscópio para garantir que elas se separaram.
Quando as células se levantarem, a 70 microliters de cultura média a cada cilindro para inativar a trippsina. Use uma pipeta de 200 microliter para misturar suavemente a suspensão da célula, certificando-se de não mover o cilindro durante a mistura. Coloque duas placas de 24 poços, e rotule-as de placa A e placa B.Adicione um mililitro de DMEM a cada poço.
Adicione 30 microliters de suspensão celular a cada poço da placa A, e adicione 70 microliters aos poços correspondentes da placa B.Coloque as placas de volta na incubadora. Quando as células da placa B estiverem com 90% de confluência, remova a mídia e lave cuidadosamente as células com um mililitro de PBS. Remova completamente o PBS e adicione 50 microliters de 1X buffer de carregamento SDS-PAGE para lise as células.
Após cinco minutos, transfira o lisecelular da placa de 24 poços para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Ferva as amostras a 100 graus Celsius por 10 minutos. Execute as amostras em gel de 10% SDS a uma tensão constante de 80 volts por 15 minutos e depois a 120 volts por uma hora.
Em seguida, transfira a proteína para uma membrana de flúor de polivinida por transferência molhada a uma corrente constante de 400 miliamperes por duas horas. Diluir o anticorpo primário por um fator de 5.000 em 5% de leite sem gordura que é dissolvido em TBST. Adicione o anticorpo FLAG à membrana e incubar a quatro graus Celsius durante a noite.
Utilizando um agitador decoloramento definido para 200 RPM, lave a membrana com TBST por 15 minutos, atualizando o TBST a cada cinco minutos. Em seguida, diluir um anticorpo secundário anti-rato por um fator de 10.000 em leite sem gordura de 5%. Incubar a membrana com anticorpo secundário diluído a quatro graus Celsius por cinco a seis horas.
Lave a membrana no agitador decoloramento novamente como descrito anteriormente. Depois disso, use a chemiluminescência aprimorada ocidental e um sistema de documentação de gel para imagem da membrana e detectar a expressão FLAG. Primeiro, colete as células HT29 e HT29-DR3 por tentativa de insinização, e use um contador automático de células para medir a densidade celular.
Semear as células nos poços de placas de 12 poços com DMEM a uma densidade de 30.000 células por poço, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 10 nanomolares de diazonamida a cada poço que contenha células usando 1%DMSO como controle negativo, e transfira as placas para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas de tratamento, imagem as células sob um microscópio a 10 vezes a ampliação.
Em seguida, sementes ambas as células HT29 e HT29-DR3 nos poços de placa de 96 poços com DMEM a uma densidade de 3.000 células por poço, e permitem que elas cresçam a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione concentrações de diazonamida de aumento de dose, conforme descrito no protocolo de texto. Após 48 horas de tratamento, use um kit de ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência para medir a viabilidade celular.
Retire a placa de 96 poços da incubadora e deixe-a em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. Em seguida, adicione 50 microliters de reagentes de ensaio a cada poço, e agite a placa por dois minutos à temperatura ambiente para lise as células. Incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, usar um leitor de microplaca para determinar a luminescência de cada poço.
A caracterização das células HT29 expressando o DR3 revela que os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem não mostram expressão genética exógena. Os genes um e cinco são vistos para expressar os mais altos níveis de DR3, e por isso são escolhidos para outros experimentos. A morfologia das células HT29 e HT29-DR3 são observadas após serem tratadas por 48 horas com diazonamida.
As células HT29-DR3 exibem apoptose óbvia com uma membrana celular quebrada e detritos celulares. No entanto, as células HT29 mostram apenas apreensão mitótica com células intactas que exibem uma forma de célula arredondada. A viabilidade celular desses tipos de células é então determinada após ser tratada por 48 horas com três nanomolares de diazonamida.
As células HT29-DR3 são vistas com uma morte celular de mais de 80%, enquanto as células HT29 parentais demonstram apenas uma ligeira resposta na forma de prisão mitótica. Isso indica que a superexpressão do DR3 reconstituiu a via apoptóica induzida pela diazonamida nessas células. Diluições seriais adequadas são importantes para obter a densidade ideal de clones únicos.
Também é importante garantir que cada cilindro clone contenha apenas uma colônia e evite contaminar colônias próximas. As linhas celulares superexpressas dr3 facilitaram o estudo bioquímico dos mecanismos moleculares in vitro. Geramos xenoenxertos HT29-DR3 através de injeção subcutânea de células HT29-DR3, e ajudou a elaborar os mecanismos de apoptose induzida por agentes antimitóticos in vivo.
Este protocolo pode ser usado para estudar genes de interesse em outras linhas celulares. Além disso, o gene knockout é outra maneira de estudo funcional, e nosso protocolo pode ser adaptado aos sistemas de knockdown genético. Assim, é geralmente aplicável a funções genéticas elucidadas.
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