Überexexemitende Gene in Zellen ist ein wichtiger Weg, um die Genfunktion zu untersuchen. Durch stabile Transfektion mit dem Retrovirus können endogene Gene in das Wirtsgenom integriert und kontinuierlich exprimiert werden. Wir nahmen einzelne Kolonien der retroviralen Infektion auf und erzeugten stabile Zelllinien, die MIT FLAG-tags DR3 überdezentrale.
Die Zelllinien kompensierten die Nichtverfügbarkeit guter DR3-Antikörper und lieferten hervorragende Werkzeuge für die DR3-Funktionsstudie nach in vitro und in vivo. Wir erzeugten die DR3-Überexpressionszelllinien, indem wir eine einzige Kolonie der retroviralen Infektion aufgriffen. Zelllinien aus einer einzigen Kolonie könnten die Homogenität und Reinheit erhalten.
Darüber hinaus ist das Protokoll einfach und einfach zu handhaben. Um dieses Verfahren zu beginnen, wachsen Plat-A-Zellen über Nacht in 60-Millimeter-Gerichte mit vier Milliliter DMEM. Wenn Zellen 80 bis 90 % Konfluss erreichen, verwenden Sie Transfektionsreagenz, um sie mit zwei Mikrogramm des konstruierten Plasmids zu transfekieren, wie im Handbuch des Herstellers beschrieben.
Nach 72 Stunden, sammeln Sie den Überstand. Mit einem 0,45 Mikrometer sterilen Filter, filtern Sie die Medien, und halten Sie die virale Suspension im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Als nächstes wachsen HT29-Zellen über Nacht in einer 60-Millimeter-Schale mit DMEM, die die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.
Wenn die Zellen 30 bis 50% Konfluss erreichen, infizieren Sie sie mit zwei Milliliterviral viraler Suspension in Gegenwart von acht Mikrogramm Polybren pro Milliliter viraler Suspension. Inkubieren Sie die infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden. Dann, aspirieren Sie die virale Suspension.
Fügen Sie vier Milliliter frisches DMEM hinzu und geben Sie das Gericht in den Inkubator zurück. Nach einer 24-stündigen Infektion die Medien von den Tellern entfernen und die Zellen vorsichtig mit zwei Millilitern vorgewärmter PBS waschen. Fügen Sie einen Milliliter Trypsin EDTA hinzu und brüten Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Beobachten Sie mit einem Mikroskop bei der 10-fachen Vergrößerung die Zellen, um sicherzustellen, dass sich die meisten von ihnen gelöst haben. Danach fügen Sie zwei Milliliter DMEM mit 10%FBS hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen, und sammeln Sie die Zellsuspension in einer 15-Milliliter-Röhre. Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand.
Das Zellpellet in 10 Milliliter DMEM wieder aufhängen und sanft nach oben und unten pipette auf und ab, um es zu mischen. Anschließend verdünnen Sie die Zellen mit Faktoren von 30, 100 und 300. Samen der Zellen sind 150-Millimeter-Gerichte, die jeweils 20 Milliliter DMEM enthalten, die Blasticidin in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter enthalten.
Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für etwa ein bis zwei Wochen inkubieren. Während dieser Zeit verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um die Kolonien jeden Tag zu beobachten. Markieren Sie die gut isolierten Kolonien auf dem Boden der Schale, wenn der Durchmesser der Kolonien etwa ein bis zwei Millimeter beträgt.
Wenn die Inkubationszeit abgeschlossen ist, das Medium ansaugen und die Zellen mit drei Millilitern vorgewärmtem PBS waschen. Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin EDTA in eine 60-Millimeter-Schale. Verwenden Sie sterile Zangen, um autoklavierte sterile Klonzylinder aufzunehmen und in die Schüssel zu legen.
Dann nehmen Sie die Zylinder, die jetzt jeweils etwa 30 Mikroliter Trypsin EDTA enthalten, und legen Sie sie vorsichtig über die markierten Kolonien. Bringen Sie das Gericht für drei Minuten in den Brutkasten zurück. Überprüfen Sie danach die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich gelöst haben.
Wenn die Zellen angehoben haben, bei 70 Mikroliter Kulturmedium zu jedem Zylinder, um das Trypsin zu inaktivieren. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die Zellsuspension sanft zu mischen, um sicherzustellen, dass der Zylinder beim Mischen nicht bewegt wird. Legen Sie zwei 24-Well-Platten fest und beschriften Sie sie Mitblech A und Platte B. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter DMEM hinzu.
Fügen Sie 30 Mikroliter Zellsuspension zu jedem Brunnen der Platte A hinzu und fügen Sie 70 Mikroliter zu den entsprechenden Plattenbrunnen B hinzu. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Wenn die Zellen in Platte B bei 90% Zusammenfluss sind, entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter PBS. Die PBS wurden vollständig entfernt, und fügen Sie 50 Mikroliter 1X SDS-PAGE-Ladepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren.
Nach fünf Minuten die Zelle lysieren von der 24-Well-Platte auf 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren. Kochen Sie die Proben bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Führen Sie die Proben auf 10%SDS Gel mit einer konstanten Spannung von 80 Volt für 15 Minuten und dann bei 120 Volt für eine Stunde.
Dann übertragen Sie das Protein durch Nasstransfer bei einem konstanten Strom von 400 Milliampere für zwei Stunden auf eine Polyvinylidenfluoridmembran. Verdünnen Sie den primären Antikörper um den Faktor 5.000 in 5% fettfreier Milch, die in TBST gelöst wird. Fügen Sie den FLAG-Antikörper in die Membran ein und brüten Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.
Mit einem Auf 200 Umdrehungen pro Minute eingestellten Entfärbungs-Shaker die Membran 15 Minuten lang mit TBST waschen und den TBST alle fünf Minuten erfrischen. Verdünnen Sie dann einen Anti-Maus-Sekundärantikörper um den Faktor 10 000 in 5% fettfreier Milch. Inkubieren Sie die Membran mit verdünntem Sekundärantikörper bei vier Grad Celsius für fünf bis sechs Stunden.
Waschen Sie die Membran wieder auf dem Entfärbungsshaker, wie zuvor beschrieben. Verwenden Sie anschließend die westliche verbesserte Chemilumineszenz und ein Gel-Dokumentationssystem, um die Membran abzubilden und den FLAG-Ausdruck zu erkennen. Sammeln Sie zunächst sowohl HT29- als auch HT29-DR3-Zellen durch Trypsinisierung, und verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die Zelldichte zu messen.
Säen Sie die Zellen in die Brunnen von 12-Well-Platten mit DMEM mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Brunnen, und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag 10 Nanomolar Diazonamid in jeden Brunnen geben, der Zellen enthält, die 1%DMSO als Negativkontrolle verwenden, und übertragen Sie die Platten zu einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach 48 Stunden Behandlung, bilden die Zellen unter dem Mikroskop mit der 10-fachen Vergrößerung.
Als nächstes säen Sie sowohl HT29- als auch HT29-DR3-Zellen in die Brunnen der 96-Well-Platte mit DMEM mit einer Dichte von 3.000 Zellen pro Brunnen und lassen sie über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen. Am nächsten Tag, fügen Sie dosiseskalierende Diazonamid-Konzentrationen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie nach 48 Stunden Behandlung ein auf Lumineszenz basierendes Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit, um die Zelllebensfähigkeit zu messen.
Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Assay-Reagenzien zu jedem Brunnen hinzu und schütteln Sie die Platte für zwei Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu lysieren. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten, und verwenden Sie dann einen Mikroplattenleser, um die Lumineszenz jedes Brunnens zu bestimmen.
Die Charakterisierung von HT29-Zellen, die DR3 stabil exprimieren, zeigt, dass die Klone unterschiedliche DR3-Werte ausdrücken, während die Wildtypzellen keine exogene Genexpression zeigen. Die Gene eins und fünf sind als Ausdruck der höchsten DR3-Werte angesehen und werden daher für weitere Experimente ausgewählt. Die Morphologie der HT29- und HT29-DR3-Zellen wird nach 48 Stunden Behandlung mit Diazonamid beobachtet.
HT29-DR3-Zellen zeigen offensichtliche Apoptose mit einer gebrochenen Zellmembran und Zellablagerungen. HT29-Zellen zeigen jedoch nur mitotische Abnahme mit intakten Zellen, die eine aufgerundte Zellform aufweisen. Die Zelllebensfähigkeit dieser Zelltypen wird dann nach 48 Stunden Behandlung mit drei Nanomolaren Diazonamid bestimmt.
HT29-DR3-Zellen haben einen Zelltod von über 80%, während die elterlichen HT29-Zellen nur eine leichte Reaktion in Form von mitotischem Arrest zeigen. Dies deutet darauf hin, dass die Überexpression von DR3 den Diazonamid-induzierten apoptotischen Weg in diesen Zellen rekonstituiert hat. Richtige serielle Verdünnungen sind wichtig, um eine optimale Dichte von einzelnen Klonen zu erhalten.
Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass jeder Klonzylinder nur eine Kolonie enthält und um zu vermeiden, dass nahegelegene Kolonien kontaminiert werden. Die DR3-überexexemitten Zelllinien erleichterten die biochemische Untersuchung der molekularen Mechanismen in vitro. Wir erzeugten HT29-DR3 Xenografts durch subkutane Injektion von HT29-DR3-Zellen, und es half, die Mechanismen der antimitotischen Wirkstoffe-induzierte Apoptose in vivo zu erarbeiten.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gene von Interesse in anderen Zelllinien zu studieren. Darüber hinaus ist Gen Knockout eine weitere Möglichkeit für funktionelle Studien, und unser Protokoll kann an die Gen-Knockdown-Systeme angepasst werden. Daher ist es allgemein anwendbar auf erhellengene Genfunktionen.
Denken Sie daran, das Virus-Relay an den Müll zu bestimmten Containern zur Sicherheitsentsorgung zu legen.
