细胞中基因的表达是研究基因功能的重要方法。逆转录病毒的稳定转染使内源基因能够整合到宿主基因组中并持续表达。我们拿起逆转录病毒感染的单菌落，并生成稳定的细胞系过度表达 FLAG 标记的 DR3。
细胞系弥补了良好的 DR3 抗体的不可用性，并为体外和体内的 DR3 功能研究提供了出色的工具。我们通过拾取一个逆转录病毒感染的群体生成了 DR3 过度表达细胞系。来自单个菌落的细胞系可以保持同质性和纯度。
此外，该协议易于处理。为了开始这个程序，在60毫米的盘子中用4毫升DMEM一夜之间种植板-A细胞。当细胞达到80至90%汇合时，使用转染试剂用制造商手册中概述的两微克的构造质粒进行转染。
72小时后，收集上经剂。使用0.45微米无菌过滤器，过滤介质，使病毒悬浮液在黑暗中保持4摄氏度。接下来，用DMEM在60毫米的培养皿中隔夜生长HT29细胞，用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。
当细胞达到30-50%的汇合，感染他们两毫升的病毒悬浮液，在8微克的多布雷尼每毫升病毒悬浮液的存在。在37摄氏度下孵育受感染的细胞4至6小时。然后，吸病毒悬浮液。
加入四毫升新鲜DMEM，并将菜回孵化器。感染后24小时，从盘子中取下介质，用两毫升预热PBS小心清洗细胞。加入一毫升的尝试性EDTA，并在37摄氏度下孵育细胞3分钟。
使用显微镜放大10倍，观察细胞，以确保它们中的大多数已经分离。在此之后，加入两毫升含有10%FBS的DMEM，以停止三辛化，并在15毫升管中收集细胞悬浮液。在室温下以200倍g离心5分钟，取出上一代。
将细胞颗粒重新悬浮在 10 毫升 DMEM 中，然后轻轻上下移液器混合。接下来，用30、100和300因子稀释细胞。种子细胞是150毫米的盘子，每个含有20毫升DMEM含有爆炸素，浓度为每毫升1微克。
在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育约一至两周。在此期间，使用放大倍数10倍的倒置显微镜每天观察菌落。当菌落的直径约为一到两毫米时，标记菜底上分离良好的菌落。
当潜伏期结束时，吸气介质，用三毫升预热PBS清洗细胞。在60毫米的菜中加入两毫升的尝试素EDTA。使用无菌钳子拾取自检的无菌克隆瓶，并把它们放在培养皿中。
然后，拿起圆柱体，现在每个都含有约30微升的三角素EDTA，并轻轻地把它们放在标记的殖民地。将菜返回孵化器三分钟。在此之后，在显微镜下检查细胞，以确保它们已分离。
当细胞提升时，在70微升的培养介质到每个圆柱体，以灭活的三平素。使用 200 微升移液器轻轻混合电池悬架，确保混合时不要移动气缸。设置两个24孔板，并标记他们板 A 和板 B. 添加一毫升 DMEM 到每个孔.
在板 A 的每个孔中加入 30 微升的细胞悬浮液，并在板 B 的相应孔中加入 70 微升。当板 B 中的细胞处于 90% 汇合时，取出介质，用一毫升 PBS 小心地清洗细胞。完全删除 PBS，并添加 50 微升 1X SDS-PAGE 加载缓冲液来对细胞进行切片。
五分钟后，将细胞酸盐从24井板转移到1.5毫升离心管。将样品在100摄氏度下煮10分钟。在 10%SDS 凝胶上以 80 伏的恒定电压运行样品 15 分钟，然后在 120 伏特下运行 1 小时。
然后以400毫安的恒定电流湿转至聚乙烯氟化物膜，持续两小时。在溶解在TBST中的5%脱脂牛奶中，将原抗体稀释5000倍。将 FLAG 抗体加入膜中，并在四摄氏度下孵育过夜。
使用设置为 200 RPM 的脱色摇床，用 TBST 清洗膜 15 分钟，每五分钟刷新一次 TBST。然后，在5%脱脂牛奶中稀释抗小鼠二级抗体1万倍。用稀释的二次抗体在四摄氏度下孵育膜五至六个小时。
如前所述，再次清洗脱色摇床上的膜。在此之后，使用西方增强的化学发光和凝胶文档系统来成像膜并检测 FLAG 表达。首先，通过三位化收集HT29和HT29-DR3细胞，并使用自动细胞计数器测量细胞密度。
用DMEM将细胞播种到12孔板的井中，每孔密度为3万个细胞，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育过夜。第二天，在每孔中加入10纳米的二氮酰胺，该井含有1%DMSO的细胞作为负对，并将板转移到37摄氏度的培养箱中，用5%的二氧化碳。经过48小时的治疗，在显微镜下以10倍的放大倍率对细胞进行成像。
接下来，将HT29和HT29-DR3细胞种子到96孔板的井中，每孔3000个细胞的密度为DMEM，并允许它们一夜之间在37摄氏度下生长。第二天，添加文本协议中概述的剂量升级的二甲酰胺浓度。经过48小时的治疗，使用基于发光的细胞活力测定试剂盒测量细胞的生存能力。
从培养箱中取出 96 井板，让它在室温下站立约 30 分钟。然后，在每一个井中加入50微升的检测试剂，并在室温下摇动板两分钟，以糖细胞。在室温下孵育板10分钟，然后使用微孔板读卡器确定每孔的亮度。
HT29细胞稳定表达 DR3 的特征显示，克隆表达不同级别的 DR3，而野生细胞不显示外源基因表达。基因一和五被看到表达最高水平的 DR3，因此被选择进行进一步的实验。HT29和HT29-DR3细胞的形态在用二甲酰胺治疗48小时后被观察。
HT29-DR3细胞显示明显的凋亡与破碎的细胞膜和细胞碎片。然而，HT29细胞只显示线粒体逮捕与完整的细胞，表现出一个四舍五入的细胞形状。这些细胞类型的细胞生存能力，然后确定后，治疗48小时与三纳米摩尔酰胺。
HT29-DR3细胞的细胞死亡率超过80%，而亲的HT29细胞只表现出线粒体逮捕形式的轻微反应。这表明，DR3的超表达重组了这些细胞中由二甲酰胺诱导的凋亡通路。适当的串行稀释对于获得单克隆的最佳密度非常重要。
同样重要的是，确保每个克隆圆柱体只包含一个菌落，并避免污染附近的菌落。DR3过度表达细胞系有助于体外分子机制的生化研究。通过HT29-DR3细胞的皮下注射，我们生成了HT29-DR3异种移植，帮助阐述了体内抗药剂诱导凋亡的机制。
该协议可用于研究其他细胞系中感兴趣的基因。此外，基因敲解是功能研究的另一种方式，我们的协议可以适应基因敲除系统。因此，它一般适用于阐明基因功能。
请记住将病毒中继器丢弃到特定容器中，以进行安全处理。
