Os autores Obrigado DRS Jennifer Yang e Alexander (Sasha) Kauffman para assistência técnica com esta técnica, bem como numerosas discussões úteis e críticas. Soro hormônio ensaios foram realizados por Yang et al., 2017 do The University of Virginia centro de pesquisas em reprodução ligante ensaio e núcleo de análise, apoiado por Eunice Kennedy Shriver FORMULADORES/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fontes de apoio à pesquisa: R01 FORMULADORES 86100 (KMB), RBM foi apoiado por T32 FORMULADORES 007203.

O método descrito aqui é de acordo com o National institutos de saúde Cuidado Animal e diretrizes de uso e foram autorizados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, San Diego e institucional Cuidado Animal.
1. a aclimatação para manipulação
<ol><li>Procedimento de tratamento<ol>
<li>Coloque gaiolas de rato na biossegurança do armário. Retire o primeiro rato da gaiola e coloque sobre uma superfície apropriada (por exemplo, uma tampa de gaiola limpa) dentro da armário de biossegurança.</li>
		<li>Contenha suavemente o mouse na superfície de trabalho, mantendo a base da cauda com o indicador e o polegar de uma mão. Então, firmemente acaricie a superfície ventral da cauda, da base até a ponta da cauda, com o indicador e o polegar da outra mão. Repetir esta acariciando 6 vezes (ou seja, 1 conjunto) e retornar o mouse para sua gaiola.</li>
		<li>Esperar 6 min e repita a etapa 1.1.2. Nota: No total, passo 1.1.2 será repetido 4 vezes por rato (ou seja, 4 conjuntos de 6 cursos), para que cada rato receberá um total de 24 cursos de cauda em cada dia de tratamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A frequência de manipulação diária<ol>
<li>De cinco até duas semanas antes do dia de coleta de sangue planejada, lidar com ratos, conforme descrito na etapa 1.1, cinco dias por semana (os ratos não são tratados no sábado ou no domingo até as duas semanas finais de aclimatação).</li>
		<li>Se o tratamento experimental durante o período de amostragem incluirá qualquer manipulação adicional (por exemplo, agarrando ou injeção intraperitoneal), aclimatar os ratos para esta atividade de manipulação durante cada sessão de manipulação. Nota: Para a aclimatação aos procedimentos de injeção, utilize uma agulha cega para realizar uma injeção de Souza.</li>
		<li>Durante as duas semanas antes do dia de coleta de sangue planejada, lidar com ratos, conforme descrito no ponto 1.1, sete dias por semana.</li>
		<li>Pelo menos duas semanas antes do dia da coleta de sangue planejada, casa de ratos em pares para minimizar as interrupções aos ratos durante a amostragem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação dos tubos de colheita de sangue
<ol><li>Preparar o buffer de ensaio de LH ultra-sensível em uma garrafa de vidro: albumina de soro bovino 0,2% e 0,05% Tween-20 em PBS [0,2 g de KCl, 8 g de NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (anidro), 0,24 g KH2PO4, água ultrapura para 1 L, pH 7,4, filtro e autoclave] , loja a 4° C. 1 Nota: Volume do buffer de ensaio de LH ultra-sensível estar preparado pode ser calculado com base no número de amostras e o volume por exemplo, como indicado abaixo (2.2 & discussão)</li>
	<li>Prepare tubos de colheita de sangue (tubos de microcentrifuga de 0,6 mL). Rotule os tubos e buffer de ensaio alíquota (57 µ l de buffer por tubo; note-se, este volume pode variar dependendo do volume de sangue coletado ou a proporção do sangue para o buffer desejado). Tubos pode ser preparado dias à frente de amostragem, loja a 4 ° C.</li>
</ol>3. coleta de sangue
<ol><li>Preparação dos materiais de coleta de sangue.<ol>
<li>Preparar o gabinete de segurança biológica para uso e providenciar os seguintes materiais de capuz ou em um carrinho nas proximidades: 10 µ l Pipetar (conjunto de 3 µ l ou volume de coleta de sangue desejado), pontas de pipeta, escaninho para pontas de pipetas utilizadas, temporizador, impressão com o número de animais e amostra números (waste para notas em relação a problemas de amostragem ou animais), gelo balde com tubos de colheita de sangue, tesouras e gaze pequena (2 "x 2"). Nota: O "contar até" função com um temporizador de laboratório é útil porque ele não tem um alarme sonoro que poderia perturbar os ratos</li>
		<li>Use um marcador permanente para marcar a cauda de cada rato (perto da base) para auxiliar a identificação rápida do mouse correto durante a amostragem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recorte da preparação coleção cauda e pre-sangue.<ol>
<li>Em 45 min antes do início da coleção de sangue, remover o primeiro rato de sua gaiola e coloque sobre uma superfície apropriada (uma tampa de gaiola limpa funciona bem) dentro a biossegurança do armário.</li>
		<li>Use uma tesoura afiada, estéril para remover 1-2 mm da ponta da cauda do rato, após preparação asséptica (ou seja, esfregar com álcool e betadine). Nota: Isto pode ser realizado em animais acordados com contenção suave ou sob anestesia de isoflurano.  Além disso, analgesia pode ser fornecida após a recomendação do IACUC local.</li>
		<li>Cuidadosamente acariciar a cauda do rato como descrito acima (1.1.2; 1-2 traços são geralmente suficientes) até a gota de formas de sangue na ponta da cauda.</li>
		<li>Use uma pipeta com uma ponta limpa 3 µ l de sangue da ponta da cauda e descartar a ponta da pipeta com sangue.</li>
		<li>Antes de retornar o mouse para sua gaiola, certifique-se de que o fluxo de sangue parou. Se necessário, aplique uma pressão suave com gaze estéril.</li>
		<li>Repita as etapas 3.2.1 - 3.2.5 para todos os mouses. Podem ser colhidas amostras de sangue subsequente por firmemente acariciando cauda do rato até que uma gotícula de formas de sangue na ponta da cauda. Nota: Se uma gota de sangue não forma após pinceladas firmes, a cauda pode ser dabbed com uma gaze embebida em soro fisiológico. Os coágulos são mais propensos a forma durante a amostragem menos frequente (ou seja, > intervalos de 15 min). Uma vez que o coágulo é liberado da veia, pode continuar a amostragem.</li>
		<li>Continue a coletar 3 µ l de sangue de cada rato conforme descrito acima cada 6 min para aproximadamente 45 min, durante este período de preparação de pré-sangue coleção. Descarte a sangue e pipeta de ponta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colheita de sangue<ol>
<li>Colete 3 µ l de sangue da ponta da cauda como descrito acima. Tenha cuidado para assegurar que o inteiro 3 µ l amostra para a ponta da pipeta (sem bolhas ou contaminação de roupa de cama). Ejete a amostra de sangue para o buffer de ensaio em um tubo rotulado. Misturar por inversão e retornar o tubo de gelo.</li>
		<li>Antes de retornar o mouse para sua gaiola, certifique-se de que o fluxo de sangue parou. Se necessário, aplique uma pressão suave com gaze estéril.</li>
		<li>Repita os passos de 3.3.1 - 3.3.2 para cada mouse, cada 6 min, durante o período de amostragem predeterminado. Monitorar cada animal por sinais de perigo (pálpebras, por exemplo, parcialmente fechadas, posição encurvada [não causado por outro tratamento] ou falta de resposta ao tratamento) e encerrar a colheita de amostras, se necessário. Nota: Aflição comportamental ou outras complicações que exigem o término da amostragem extremamente raramente ocorrem em nosso laboratório.</li>
		<li>Se os animais não são sacrificados após colheita de sangue, certifique-se de que o fluxo de sangue da ponta da cauda completamente parou. Limpe qualquer sangue derramado desde o interior da cada animal gaiola (ou gaiolas de mudança) e retornar as gaiolas animais para o rack de habitação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. processamento e análise da amostra
<ol><li>Armazenar as amostras de sangue a-20 ° C até análise. Nota: LH é analisada em amostras de sangue total diluídas no buffer de ensaio; Não há separação de soro ou plasma é necessária antes de armazenamento ou análise.</li>
	<li>Amostras de sangue de ensaio por ELISA ultra-sensível como descrito anteriormente, os valores1 e relatório em ng/mL de sangue total, após a correção para a diluição do volume da amostra no buffer de ensaio.</li>
	<li>Identifica os pulsos de LH no conjunto de dados. Calcular e comparar a amplitude de pulso média e frequência de pulso (ou intervalo de pulso inter) conforme apropriado para o conjunto de dados. Nota: Programas e critérios publicados13,14 ,15,16 , para a detecção de pulsos de LH estão disponíveis.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. , (2015).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat.">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li><li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome.">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse.">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li><li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li><li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice.">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li><li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice.">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li><li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice.">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li><li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique.">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li><li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone:+differential+suppression+by+ovarian+steroids.">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li><li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes.">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li><li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DynPeak:+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series.">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).</li><li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion.">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li><li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice.">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li><li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress.">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li><li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>. Animal Welfare Inspection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017)</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrevemos um protocolo para coleta de sangue frequentes toda a cauda-dica de amostras de sangue para avaliação da secreção pulsátil de LH em camundongos. Este protocolo permite a coleta de amostras para a deteção das alterações agudas na secreção pulsátil de LH após a exposição ao estresse psicossocial e é well-suited para avaliação dos pulsos de LH sob outras manipulações agudas ou crônicas.
Um componente crítico do presente protocolo para alcançar perfis confiá...

Função gonadal em mamíferos é dependente da secreção de gonadotrofinas, hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante hormônio, da glândula pituitária. As gonadotrofinas são secretadas em um padrão pulsátil ou aumento em resposta à secreção hipotalâmica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH). A síntese e secreção de LH e FSH são regulados através de ação endócrina, parácrina e autócrina de uma variedade de moléculas incluindo GnRH hipotalâmico, hormônios esteroides gonadais e o sistema de União-inibina-folistatina, bem como uma miríade de condições fisiológicas, incluindo equilíbrio de energia e estresse. 2
O padrão pulsátil de LH no sangue que decorre uma descarga bastante abrupta de LH no sangue periférico, seguido por aproximadamente exponencial eliminação. Importantes características do padrão incluem a frequência de cada descarga de LH e a amplitude da resposta do LH, ambos os quais são ditados, em parte, pela liberação de GnRH. devido à dificuldade em coletar sangue portal do eixo hipotálamo-hipófise para medição de GnRH pulsátil, a amostragem e a medição de LH é usado como um proxy para o Regulamento de GnRH do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. Portanto, a informação crítica é codificada na frequência e a amplitude dos pulsos de LH, o que não pode ser determinada a partir de uma única amostra.
Análise da secreção pulsátil de LH historicamente tem sido limitada a grandes mamíferos (os seres humanos, primatas e ovelhas) devido ao seu volume de sangue grande e tolerância para coleta de amostra de sangue frequente. Em roedores, amostragem de sangue frequentes limitou-se o rato e conseguida através de habitação cateter atrial. 3 , 4 o custo relativamente baixo e a disponibilidade de genética (por exemplo, cre-lox, CRISPR) e manipulações de complexo circuito neural (por exemplo, optogenetics, chemogenetics) fazem ratos um organismo modelo atraente; no entanto, obtenção de amostras de sangue frequentes e posterior análise das concentrações de LH até recentemente, provou indescritíveis. Esta tarefa monumental foi pioneira por Steyn e colegas de trabalho. 1 desde então, diversos laboratórios começaram a utilizar de amostra de sangue frequentes e ensaios de LH ultra sensíveis para avaliar a secreção pulsátil de LH em uma variedade de paradigmas experimentais. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Note-se que a busca de um método prático de coletar várias amostras de sangue dos ratos foi em andamento pelo menos 40 anos10 , com vários refinamentos feitos ao longo do caminho. 11 , 12
Avaliação dos padrões de pulso do LH (ou seja, frequência e amplitude) representa um refinamento maior no acompanhamento a secreção de gonadotrofinas basal neste modelo animal geneticamente tractable. Tradicionalmente, as concentrações de LH em camundongos foram determinadas em uma amostra de sangue. Uma fraqueza de amostras de ponto único é um conjunto de dados altamente variável, porque as concentrações de LH são naturalmente flutuando durante cada pulso. Outro ponto fraco é que medidas isoladas inerentemente perder informação crítica veiculada pelos padrões de secreção de LH pulso. Assim, um método para coletar amostras de sangue frequentes em comportar-se livremente, ratos desenfreados (exceto para manuseio suave durante a amostragem) fornecerá informações avançadas e revelar-se útil para muitos laboratórios investigando Regulamento hormônio pulsátil.
Aqui, descrevemos um protocolo para a recolha de frequentes (a cada 6 min) amostras de ratos acordados, desenfreadas de sangue. É importante, inclui uma manipulação de protocolo de aclimatação que permite a detecção robusta e contínua de secreção pulsátil de LH em amostras de sangue total coletado durante um período de tempo em que pré e pós-avaliação para um desafio agudo pode ser determinado, como a resposta ao estresse psicossocial de imobilização e contenção. Um ensaio eficaz para as concentrações de LH de amostras de sangue total foi descrito anteriormente; 1 que este protocolo está focado em um método para coletar as amostras de sangue para medição de pulso do LH.

<table><tbody><tr><td>Biosaftey cabinet</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhydrous)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Purified and filtered water</td></tr><tr><td>Broome Rodent Restraint Device</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

Em muitos sistemas endócrino, hormônios ou fatores circulantes não são liberados continuamente, mas são secretados como um pulso discreto em resposta a um fator liberador. Medidas de amostragem de ponto único são inadequadas para compreender plenamente o significado biológico do padrão secretora de hormônios pulsátil ou sob condições fisiológicas normais, ou nas condições de desregulação. Hormônio luteinizante (LH) é sintetizado pelas células gonadotróficas da hipófise anterior e secretado em um padrão pulsátil que requer coleta frequente de amostras de sangue para avaliação do pulso. Isto não foi possível, em camundongos, até recentemente, devido ao desenvolvimento de um ensaio de LH de alta sensibilidade e frequente de avanço em uma técnica para coleta de amostra de baixo volume, inicialmente descrita por Steyn e colegas. 1 aqui descrevemos um protocolo para a coleta de amostra de sangue periférico frequentes de ratos com aclimatação de manipulação suficiente para detectar a secreção pulsátil de LH. O atual protocolo detalha um período de aclimatação expandida que permite a avaliação de robustos e contínuas de pulsos de LH durante várias horas. Neste protocolo, a ponta da cauda é cortada e o sangue é colhido da cauda com uma pipeta à mão. Para avaliação do LH pulsátil em ratos gonadectomized, seriais amostras são coletadas a cada 5-6 min de 90-180 min. importante, a coleta de sangue e medição de robustas pulsos de LH podem ser realizados em ratos acordados, livremente comportamento, dados a adequada manipulação aclimatação e esforço para minimizar os estressores ambientais. Aclimatação suficiente pode ser alcançada dentro de 4-5 semanas antes da coleta de sangue. Este protocolo destaca avanços na metodologia para garantir a coleta de amostras de sangue total para a avaliação dos padrões de secreção de LH pulsátil durante várias horas no mouse, um poderoso modelo animal para pesquisa neuroendócrino.

Padrões de pulso LH representativos de 4 ratos são mostrados na Figura 1 (dados reimpressos de Yang et al., 2017). LH foi medida em amostras de sangue frequentes para determinar a resposta a um desafio de estresse psicossocial agudo. Adultos camundongos C57/Bl6 fêmeas foram ovariectomia e manipulados conforme detalhado neste protocolo para coleta de sangue frequente. Foram coletadas amostras de sangue para o primeiro 90 min em todos os animais par...

Watch this Scientific Journal Video about Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion at JoVE.com

Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Aqui nós apresentamos um protocolo de amostragem de sangue de cauda-dica para coleta de amostra frequente em camundongos desenfreados. Este método é útil para avaliar os padrões de secreção pulsátil de hormônio luteinizante e pode ser adaptado para a análise de outros fatores circulantes.

Frequente de amostra de sangue da cauda-ponta em camundongos para a avaliação da secreção pulsátil de hormônio luteinizante

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K visualizações.  University of California, San Diego School of Medicine. Aqui nós apresentamos um protocolo de amostragem de sangue de cauda-dica para coleta de amostra frequente em camundongos desenfreados. Este método é útil para avaliar os padrões de secreção pulsátil de hormônio luteinizante e pode ser adaptado para a análise de outros fatores circulantes.

Vídeo: Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Modified Blood Collection from Tail Veins of Non-anesthetized Mice with a Vacuum Blood Collection System and Eyeglass Magnifier

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. The tail veins of mice are small, and it is sometimes difficult to obtain the required blood volume by conventional puncture methods. This study investigates the superiority of repeated blood sample collection from tail veins of mice through use of a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier (experimental group) compared to conventional blood sampling methods (conventional group), performed by beginners and experts, respectively. With the help of an eyeglass magnifier, a butterfly needle tip is inserted into the tail vein of each mouse in the experimental group. When the vein is penetrated successfully, a blood sample is collected in the vacuum collection tube by insertion of the rubber end of a butterfly needle into the vacuum blood collection tube. The plunger is then used to collect blood without the help of the eyeglass magnifier in the conventional group. Success rates of blood sample collection by the beginners and experts were shown to be 70% vs. 100% (p &#60; 0.01) in the experimental group and 35% vs. 85% (p &#60; 0.01) in the conventional group. For both beginners and experts, puncture times required for obtaining required blood sample were significantly lower in the experimental group compared to the conventional group (2.40 &#177; 0.75 vs. 2.90 &#177; 0.31, p &#60; 0.05; 1.15 &#177; 0.37 vs. 1.55 &#177; 0.76, p &#60; 0.05). In conclusion, the presented blood sampling technique is feasible and easy to practice and enables frequent sampling of adequate blood volumes from non-anesthetized mice.&#160;

This study reports blood sampling from tail vein in mice using a vacuum extraction tube system with eyeglass magnifier. Our method is easy to practice and could be used for repeat blood sampling in mice.

Coleta de sangue modificado de veias de cauda de ratos não anestesiados com um sistema de coleta de sangue do vácuo e óculos lupa

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. ...

Comportamento

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a lean PCOS-like mouse model that mimics women with PCOS is clinically meaningful. In this protocol, we describe such a model. By inserting a 4 mm length of DHT (dihydrotestosterone) crystal powder pellet (total length of pellet is 8 mm), and replacing it monthly, we are able to produce a PCOS-like mouse model with serum DHT levels 2 fold higher than mice not implanted with DHT (no-DHT). We observed reproductive and metabolic dysfunction without changing body weight and body composition. While exhibiting a high degree of infertility, a small subset of these PCOS-like female mice can get pregnant and their offspring show delayed puberty and increased testosterone as adults. This PCOS-like lean mouse model is a useful tool to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

We describe the development of a lean PCOS-like mouse model with&#160;dihydrotestosterone pellet to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

Um modelo de Mouse hiperandrogénicas para estudar a síndrome do ovário policístico

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Biologia do Desenvolvimento

Handling Techniques to Reduce Stress in Mice

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects on&#160;animal well-being and can also be a confounding factor for experimental variables such as anxiety measures. Over the years, handling techniques that minimize handling-related stress have been developed with a particular focus on rats, and little attention to mice. However, it has been shown that mice can be habituated to manipulations using handling techniques. Habituating mice to handling reduces stress, facilitates routine handling, improves animal wellbeing, decreases data variability, and improves experimental reliability. Despite beneficial effects of handling, the tail-pick up approach, which is particularly stressful, is still widely used. This paper provides a detailed description and demonstration of a newly developed mouse-handling technique intended to minimize the stress experienced by the animal during human interaction. This manual technique is performed over 3 days (3D-handling technique) and focuses on the animal&#39;s capacity to habituate to the experimenter. This study also shows the effect of previously established tunnel handling techniques (using a polycarbonate tunnel) and the tail-pick up technique. Specifically studied are their effects on anxiety-like behaviors, using behavioral tests (Elevated-Plus Maze and Novelty Suppressed Feeding), voluntary interaction with experimenters and physiological measurement (corticosterone levels). The 3D-handling technique and the tunnel handling technique reduced anxiety-like phenotypes. In the first experiment, using 6-month-old male mice, the 3D-handling technique significantly improved experimenter interaction. In the second experiment, using 2.5-month-old female, it reduced corticosterone levels. As such, the 3D-handling is a useful approach in scenarios where interaction with the experimenter is required or preferred, or where tunnel handling may not be possible during the experiment.

This paper describes a handling technique in mice, the 3D-handling technique, which facilitates routine handling by reducing anxiety-like behaviors and presents details on two existing related techniques (tunnel and tail handling).

Técnicas de manuseio para reduzir o estresse em camundongos

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Realizando lavado vaginal, Crystal coloração violeta, e avaliação citológica vaginal para Rato Identificação ciclo estral Staging

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Biologia

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

Coleta de sangue por punção da veia subclávia em camundongos

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Medicina

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

Avaliando a capacidade de manuseio de lipídios em camundongos

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

Avaliação da Produção de Glicose Hepática em um Modelo de Rato da Síndrome do Ovário Policístico

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Tecnologia DREADDs e amostragem automatizada de sangue

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

Autor em destaque: Infusão automatizada e amostragem de sangue para análise hormonal precisa em camundongos conscientes

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

Ativação Neuronal Remota Acoplada à Coleta Automatizada de Sangue para Induzir e Medir o Hormônio Luteinizante Circulante em Camundongos

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Frequente de amostra de sangue da cauda-ponta em camundongos para a avaliação da secreção pulsátil de hormônio luteinizante

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Coleta de sangue modificado de veias de cauda de ratos não anestesiados com um sistema de coleta de sangue do vácuo e óculos lupa

Um modelo de Mouse hiperandrogénicas para estudar a síndrome do ovário policístico

Técnicas de manuseio para reduzir o estresse em camundongos

Realizando lavado vaginal, Crystal coloração violeta, e avaliação citológica vaginal para Rato Identificação ciclo estral Staging

Coleta de sangue por punção da veia subclávia em camundongos

Avaliando a capacidade de manuseio de lipídios em camundongos

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Avaliação da Produção de Glicose Hepática em um Modelo de Rato da Síndrome do Ovário Policístico

Ativação Neuronal Remota Acoplada à Coleta Automatizada de Sangue para Induzir e Medir o Hormônio Luteinizante Circulante em Camundongos

Ativação Neuronal Remota Acoplada à Coleta Automatizada de Sangue para Induzir e Medir o Hormônio Luteinizante Circulante em Camundongos