Los autores agradecen a los Drs. Jennifer Yang y Kauffman Alexander (Sasha) para asistencia técnica con esta técnica así como numerosas discusiones útiles y críticas. Análisis de la hormona del suero fueron realizados por Yang et al., 2017 en la Universidad de Virginia centro de investigación en reproducción Ligand análisis y base de análisis, apoyado por Eunice Kennedy Shriver NIH/NICHD (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fuentes de apoyo a la investigación: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM fue apoyado por T32 NICHD 007203.

El método descrito aquí está de acuerdo con el nacional institutos de Salud Animal Care y directrices de uso y han sido autorizados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, San Diego.
1. aclimatación a la dirección
<ol><li>Procedimiento de control<ol>
<li>Ratón de lugar jaulas en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Retire el primer ratón de la jaula y el lugar en una superficie adecuada (por ejemplo una tapa de la jaula limpia) en el gabinete de seguridad de la biotecnología.</li>
		<li>Frenar suavemente el mouse sobre la superficie de trabajo manteniendo la base de la cola con el dedo índice y pulgar de una mano. Luego, firmemente movimiento la cara ventral de la cola, desde la base hasta la punta de la cola, con el índice y el pulgar de la otra mano. Repetir esto 6 veces de caricias (es decir, 1 juego) y retomar el ratón de su jaula.</li>
		<li>Esperar 6 minutos y repita el paso 1.1.2. Nota: En total, paso 1.1.2 se repetirá 4 veces por ratón (es decir, 4 grupos de 6 golpes), para que cada ratón recibirán un total de 24 movimientos de la cola en cada día de manejo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La frecuencia de manejo diario<ol>
<li>De cinco hasta dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en el paso 1.1, cinco días por semana (los ratones no se manejan en el sábado o el domingo hasta las últimas dos semanas de aclimatación).</li>
		<li>Si el tratamiento experimental durante el periodo de muestreo incluirá cualquier manejo adicional (e.g. scruffing o inyección intraperitoneal), aclimatarse a los ratones a esta actividad de manipulación durante cada sesión de tratamiento. Nota: Para la aclimatación a los procedimientos de inyección, utilizar una aguja blunted para realizar una inyección simulada.</li>
		<li>Durante las dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en 1.1, siete días por semana.</li>
		<li>Por lo menos dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, casa ratones en pares para minimizar las interrupciones a los ratones durante el muestreo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de tubos de sangre
<ol><li>Preparar el tampón de ensayo LH ultrasensible en una botella de vidrio: albúmina de suero bovino 0,2% y 0.05% Tween-20 en PBS [0,2 g de KCl, 8 g de NaCl, 1,44 g de Na2HPO4 (anhidro), 0,24 g KH2PO4, agua ultrapura a 1 L, pH 7,4, filtro y autoclave] , almacenar a 4° C. 1 Nota: Volumen de tampón de ensayo LH ultrasensible para estar preparados puede calcularse basándose en el número de muestras y el volumen por ejemplo como se indica a continuación (2.2 y discusión)</li>
	<li>Preparar tubos (tubos de microcentrífuga de 0,6 mL) de sangre. Etiqueta de tubos y buffer de ensayo alícuota (57 μl de tampón por tubo; de nota, este volumen puede variar dependiendo del volumen de sangre recogida o la relación de la sangre en el búfer deseado). Tubos puede ser preparado días antes de la toma de muestras, almacenar a 4 ° C.</li>
</ol>3. sangre
<ol><li>Preparación de materiales de colección de sangre.<ol>
<li>Preparar el gabinete de seguridad para su uso y organizar los materiales en la campana o en un carrito cerca de: 10 μl de pipeta (set 3 μl o volumen de la colección de sangre deseado), las puntas de pipeta, cubo de basura para puntas de pipeta usadas, temporizador, impresión con el número de animales y muestra números ( Notas sobre problemas de muestreo o animales), cubo con tubos sangre, tijeras y gasas pequeñas (2 "x 2") de hielo. Nota: El "contar hasta" función de un temporizador de laboratorio es útil porque tiene una alarma audible que podría molestar a los ratones</li>
		<li>Utilice un marcador permanente para marcar la cola de cada ratón (cerca de la base) para ayudar en la identificación rápida del ratón correcto durante el muestreo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recorte de la preparación de la cola y la sangre de la colección.<ol>
<li>A 45 minutos antes del inicio de la colección de sangre, quite el primer ratón de su jaula y coloque sobre una superficie adecuada (una tapa de la jaula limpia funciona bien) dentro de la bioseguridad gabinete.</li>
		<li>Utilizar tijeras afiladas, estériles para eliminar 1-2 mm de la punta de la cola de ratón, siguiendo la preparación aséptica (es decir, frote con alcohol y betadine). Nota: Esto puede lograrse en animales despiertos con sujeción suave o bajo anestesia isoflurano.  Además, la analgesia puede ser proporcionada siguiendo las recomendaciones de la IACUC local.</li>
		<li>La cola del ratón del movimiento cuidadosamente como se describió anteriormente (1.1.2; son generalmente suficientes trazos 1-2) hasta la gota de sangre en la punta de la cola.</li>
		<li>Utilice una pipeta con una punta limpia para recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola y deseche la punta de la pipeta con sangre.</li>
		<li>Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.</li>
		<li>Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.5 para todos los ratones. Pueden recoger muestras de sangre subsecuente por firmemente acariciando la cola del ratón hasta una gota de sangre en la punta de la cola. Nota: Si una gota de sangre no se forma después de trazos firmes, la cola puede ser secó con una gasa empapada en solución salina. Los coágulos tienen más probabilidades de forma durante el muestreo menos frecuente (es decir, > intervalos de 15 min). Una vez que se elimina el coágulo de la vena, puede continuar el muestreo.</li>
		<li>Seguir recoger 3 μl de sangre de cada ratón como descrito cada 6 minutos durante aproximadamente 45 minutos, durante este período de preparación de muestras de sangre antes. Deseche la punta de sangre y pipeta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muestra de sangre<ol>
<li>Recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola como se describió anteriormente. Tener precaución para asegurar que toda la muestra de 3 μl se tiene en la punta de la pipeta (sin burbujas o contaminación de la ropa de cama). Extraer la muestra de sangre en el buffer de ensayo en un tubo etiquetado. Mezclar por inversión y devolver el tubo en hielo.</li>
		<li>Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.</li>
		<li>Repita los pasos 3.3.1 - 3.3.2 para cada ratón, cada 6 minutos, durante el tiempo de muestreo predeterminado. Seguimiento de cada animal para detectar signos de sufrimiento (e.g. parcialmente cerrados párpados, posición jorobada [no causado por otro tratamiento] o falta de respuesta al tratamiento) y terminar el muestreo, si es necesario. Nota: Dificultades conductuales u otras complicaciones que requieren terminación de muestreo ocurren muy raramente en nuestro laboratorio.</li>
		<li>Si los animales no son sacrificados después de tomar muestras de sangre, asegúrese de que el flujo de sangre desde la punta de la cola se haya detenido completamente. Limpie cualquier sangre derramada desde el interior de cada animal jaula (o cambio jaulas) y volver a las jaulas de animales a la cremallera de la cubierta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. procesamiento y análisis de la muestra
<ol><li>Almacenar las muestras de sangre a-20 ° C hasta su análisis. Nota: LH se evaluaron en muestras de sangre entera diluidas en tampon de ensayo; no hay separación de sueros o plasma es requerida antes de almacenamiento o análisis.</li>
	<li>Las muestras de sangre de análisis por ELISA ultrasensible como describen previamente1 e informe valores en ng/mL de sangre después de corrección por dilución del volumen de muestra en el tampón de ensayo.</li>
	<li>Identificar los pulsos de LH en el conjunto de datos. Calcular y comparar la amplitud de pulso promedio y frecuencia del pulso (o intervalo de inter-pulso) según corresponda para el conjunto de datos. Nota: Programas y criterios publicados13,14 ,15,16 para la detección de pulsos de LH están disponibles.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. , (2015).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat.">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li><li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome.">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse.">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li><li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li><li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice.">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li><li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice.">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li><li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique.">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li><li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone:+differential+suppression+by+ovarian+steroids.">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li><li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes.">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li><li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DynPeak:+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series.">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).</li><li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion.">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li><li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice.">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li><li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress.">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li><li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>. Animal Welfare Inspection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017)</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe un protocolo para recogida de sangre frecuente de muestras de sangre entera cola de punta para la evaluación de la secreción pulsátil de LH en ratones. Este protocolo permite la recogida de muestras para la detección de cambios agudos en la secreción pulsátil de LH después de la exposición a estrés psicosocial y es adecuado para la evaluación de pulsos de LH bajo otras manipulaciones agudas o crónicas.
Un componente fundamental de este protocolo para lograr perfile...

Función de la gónada en mamíferos depende de la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante hormona de la glándula pituitaria. Las gonadotropinas son secretadas en un patrón pulsátil o surge en respuesta a la secreción hipotalámica de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). La síntesis y secreción de LH y FSH están reguladas a través de la acción endocrina, paracrina y autocrina de una variedad de moléculas GnRH hipotalámico, las hormonas esteroides gonadales y el sistema inhibina-activina-folistatina, así como una miríada de condiciones fisiológicas incluyendo balance de tensión y energía. 2
El patrón pulsátil de la LH en sangre surge de una descarga más bien abrupta de la LH en sangre periférica, seguida por aproximadamente exponencial eliminación. Importantes características del modelo incluyen la frecuencia de cada descarga de LH y la amplitud de la respuesta de la LH, que son dictadas, en parte, por la liberación de GnRH. debido a la dificultad en la recolección de sangre portal hipotalámico-hipofisario para la medición de GnRH pulsátil, el muestreo y la medición de la LH se utiliza como proxy para la regulación de GnRH del eje hipotalámico-pituitario-gonadal. Por lo tanto, información crítica está codificada en la frecuencia y amplitud de pulsos de LH, que no se puede determinar de una sola muestra.
Análisis de la secreción pulsátil de LH ha sido históricamente limitado a grandes mamíferos (seres humanos, primates y ovejas) debido a su volumen de sangre grande y tolerancia para la recogida de muestras de sangre frecuentes. En roedores, tomar muestras de sangre frecuentes se limitaba a la rata y través de la sonda permanente. 3 , 4 el relativamente bajo costo y la disponibilidad de la genética (por ejemplo, cre-lox, CRISPR) y manipulaciones de circuito neuronales complejas (e.g. optogenetics, chemogenetics) ratones un organismo modelo atractivo; sin embargo, obtención de muestras de sangre frecuentes y posterior análisis de las concentraciones de LH ha hasta recientemente, probado evasivos. Esta tarea monumental fue pionero por Steyn y compañeros de trabajo. 1 desde entonces, varios laboratorios han empezado a utilizar el análisis de LH ultra sensibles para evaluar la secreción pulsátil de LH en una variedad de paradigmas experimentales y tomar muestras de sangre frecuentes. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 cabe señalar que la búsqueda de un método práctico de recoger múltiples muestras de sangre de los ratones ha sido en curso por lo menos 40 años10 con múltiples mejoras a lo largo de la manera. 11 , 12
Evaluación de patrones de pulso de LH (es decir, frecuencia y amplitud) representa un refinamiento importante en la supervisión de la secreción de gonadotropina basal en este modelo animal genéticamente manejable. Tradicionalmente, las concentraciones de LH en ratones se determinan en una muestra de sangre solo. Una debilidad de las muestras de un solo punto es un conjunto de datos altamente variable porque las concentraciones de LH son naturalmente fluctuantes durante cada pulso. Otra debilidad es que las mediciones aisladas inherentemente perder información crítica por los patrones de secreción de pulsos de LH. Por lo tanto, un método para recoger muestras de sangre frecuente en comportarse libremente, ratones sin restricciones (excepto la dirección apacible durante el muestreo) proporcionará mayor información y ser útiles a muchos laboratorios de investigación de la regulación pulsátil de la hormona.
Aquí, describimos un protocolo para la recogida de frecuentes muestras de ratones despiertos, libre de la sangre (cada 6 minutos). Lo importante, incluimos una dirección Protocolo de aclimatación que permite detección sólida y continua de la secreción pulsátil de LH en muestras de sangre entera recogida durante un período de tiempo en el que pre- y post-evaluación un reto agudo puede ser determinado, como la respuesta al estrés psicosocial de inmovilización y sujeción. Un ensayo eficaz para determinar las concentraciones de LH de muestras de sangre entera se ha descrito anteriormente; 1 el presente Protocolo se centra en un método para la recolección de las muestras de sangre para la medición del pulso de LH.

<table><tbody><tr><td>Biosaftey cabinet</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhydrous)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Purified and filtered water</td></tr><tr><td>Broome Rodent Restraint Device</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

En muchos sistemas endocrinos, circulación factores u hormonas no son liberadas continuamente, pero son secretadas como un discreto impulso en respuesta a un factor de liberación. Muestreo de un solo punto las medidas es insuficiente para comprender el significado biológico del patrón secretor de hormonas pulsátiles bajo condiciones fisiológicas normales o en condiciones de desregulación. La hormona luteinizante (LH) es sintetizada por las células del gonadotrope pituitario anterior y secretada en forma pulsátil que requiere frecuente recolección de muestras de sangre para la evaluación del pulso. Esto no ha sido posible en los ratones hasta que recientemente, debido al desarrollo de un análisis de LH de alta sensibilidad y progreso en una técnica de frecuente recolección de muestras de bajo volumen, inicialmente descrita por Steyn y colegas. 1 aquí se describe un protocolo para la recogida de muestras frecuentes de sangre periférica de ratones con aclimatación de manejo suficiente para detectar la secreción pulsátil de LH. El actual protocolo de detalles de un período de aclimatación ampliada que permite la evaluación de pulsos sólidas y continuadas de LH durante varias horas. En este protocolo, la punta de la cola se recorta y se recoge la sangre de la cola con una pipeta de mano. Para la evaluación de la LH pulsátil en ratones gonadectomized, muestras seriales son recogidos cada 5-6 min. 90-180 minutos, la recolección de sangre y medición de robustos pulsos de LH se pueden lograr en ratones despiertos, comportarse libremente, dados el manejo adecuado aclimatación y el esfuerzo para minimizar los factores de estrés ambientales. Aclimatación suficiente puede lograrse dentro de 4-5 semanas antes de la recogida de sangre. Este protocolo destaca avances en la metodología para recolección de muestras de sangre para la evaluación de los patrones de secreción pulsátiles de LH durante varias horas en el ratón, un modelo animal de gran alcance de investigación neuroendocrina.

Representante patrones de pulso de LH de 4 ratones se muestran en la figura 1 (datos reimprimidos de Yang et al., 2017). LH se midió en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Ratones C57/Bl6 hembra adultos fueron ovariectomizadas y manejados como se detalla en el presente Protocolo para la recogida de sangre frecuentes. Se recolectaron muestras de sangre para los primeros 90 minutos en ...

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Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.

Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K vistas.  University of California, San Diego School of Medicine. Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.

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Modified Blood Collection from Tail Veins of Non-anesthetized Mice with a Vacuum Blood Collection System and Eyeglass Magnifier

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. The tail veins of mice are small, and it is sometimes difficult to obtain the required blood volume by conventional puncture methods. This study investigates the superiority of repeated blood sample collection from tail veins of mice through use of a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier (experimental group) compared to conventional blood sampling methods (conventional group), performed by beginners and experts, respectively. With the help of an eyeglass magnifier, a butterfly needle tip is inserted into the tail vein of each mouse in the experimental group. When the vein is penetrated successfully, a blood sample is collected in the vacuum collection tube by insertion of the rubber end of a butterfly needle into the vacuum blood collection tube. The plunger is then used to collect blood without the help of the eyeglass magnifier in the conventional group. Success rates of blood sample collection by the beginners and experts were shown to be 70% vs. 100% (p &#60; 0.01) in the experimental group and 35% vs. 85% (p &#60; 0.01) in the conventional group. For both beginners and experts, puncture times required for obtaining required blood sample were significantly lower in the experimental group compared to the conventional group (2.40 &#177; 0.75 vs. 2.90 &#177; 0.31, p &#60; 0.05; 1.15 &#177; 0.37 vs. 1.55 &#177; 0.76, p &#60; 0.05). In conclusion, the presented blood sampling technique is feasible and easy to practice and enables frequent sampling of adequate blood volumes from non-anesthetized mice.&#160;

This study reports blood sampling from tail vein in mice using a vacuum extraction tube system with eyeglass magnifier. Our method is easy to practice and could be used for repeat blood sampling in mice.

Colección de sangre modificada de las venas de la cola de los ratones no anestesiados con un sistema de colección de sangre vacío y gafas lupa

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. ...

Investigación

Comportamiento

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a lean PCOS-like mouse model that mimics women with PCOS is clinically meaningful. In this protocol, we describe such a model. By inserting a 4 mm length of DHT (dihydrotestosterone) crystal powder pellet (total length of pellet is 8 mm), and replacing it monthly, we are able to produce a PCOS-like mouse model with serum DHT levels 2 fold higher than mice not implanted with DHT (no-DHT). We observed reproductive and metabolic dysfunction without changing body weight and body composition. While exhibiting a high degree of infertility, a small subset of these PCOS-like female mice can get pregnant and their offspring show delayed puberty and increased testosterone as adults. This PCOS-like lean mouse model is a useful tool to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

We describe the development of a lean PCOS-like mouse model with&#160;dihydrotestosterone pellet to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Biología del Desarrollo

Handling Techniques to Reduce Stress in Mice

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects on&#160;animal well-being and can also be a confounding factor for experimental variables such as anxiety measures. Over the years, handling techniques that minimize handling-related stress have been developed with a particular focus on rats, and little attention to mice. However, it has been shown that mice can be habituated to manipulations using handling techniques. Habituating mice to handling reduces stress, facilitates routine handling, improves animal wellbeing, decreases data variability, and improves experimental reliability. Despite beneficial effects of handling, the tail-pick up approach, which is particularly stressful, is still widely used. This paper provides a detailed description and demonstration of a newly developed mouse-handling technique intended to minimize the stress experienced by the animal during human interaction. This manual technique is performed over 3 days (3D-handling technique) and focuses on the animal&#39;s capacity to habituate to the experimenter. This study also shows the effect of previously established tunnel handling techniques (using a polycarbonate tunnel) and the tail-pick up technique. Specifically studied are their effects on anxiety-like behaviors, using behavioral tests (Elevated-Plus Maze and Novelty Suppressed Feeding), voluntary interaction with experimenters and physiological measurement (corticosterone levels). The 3D-handling technique and the tunnel handling technique reduced anxiety-like phenotypes. In the first experiment, using 6-month-old male mice, the 3D-handling technique significantly improved experimenter interaction. In the second experiment, using 2.5-month-old female, it reduced corticosterone levels. As such, the 3D-handling is a useful approach in scenarios where interaction with the experimenter is required or preferred, or where tunnel handling may not be possible during the experiment.

This paper describes a handling technique in mice, the 3D-handling technique, which facilitates routine handling by reducing anxiety-like behaviors and presents details on two existing related techniques (tunnel and tail handling).

Técnicas de manejo para reducir el estrés en ratones

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y Evaluación citológica vaginal para ratón Celo identificación Staging Ciclo

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Biología

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

Recolección de sangre a través de punción venosa Subclaviana en ratones

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Medicina

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

Evaluación de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Tecnología DREADDs y toma de muestras de sangre automatizadas

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

Autor destacado: Infusión automatizada y muestreo de sangre para un análisis hormonal preciso en ratones conscientes

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

Activación neuronal remota junto con muestreo de sangre automatizado para inducir y medir la hormona luteinizante circulante en ratones

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

Resumen

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Colección de sangre modificada de las venas de la cola de los ratones no anestesiados con un sistema de colección de sangre vacío y gafas lupa

Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

Técnicas de manejo para reducir el estrés en ratones

Realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y Evaluación citológica vaginal para ratón Celo identificación Staging Ciclo

Recolección de sangre a través de punción venosa Subclaviana en ratones

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata

Evaluación de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico

Activación neuronal remota junto con muestreo de sangre automatizado para inducir y medir la hormona luteinizante circulante en ratones

Activación neuronal remota junto con muestreo de sangre automatizado para inducir y medir la hormona luteinizante circulante en ratones