Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade de Cornell. Este trabalho fez uso do centro Cornell para materiais compartilhados instalações de pesquisa, que são suportados pelo programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconhece apoio por uma bolsa de pesquisa da pós-graduação NSF (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka para assistência com os experimentos de cálcio. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

Nota: ácidos concentrados e bases são usadas nesta síntese. Usar todas as práticas de segurança adequadas ao realizar a reação, incluindo o uso de controles de engenharia (coifa) e equipamentos de proteção individual (EPI) incluindo óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados.
 1. preparação de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>síntese de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12 <ol><li>dissolver 1,00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 mmol) em 5 mL de H 2 Cool O. a solução de marrom escura a 0 ° C em banho de gelo. Adicione 11 mL (0,23 mol) da solução de hidrato de hidrazina 80% de forma gota a gota. A reação inicial será vigorosa com o gás de evolução, resultando em uma solução de marrom. Deixe a solução resultante agitar à temperatura de 16 h; a solução final será vermelho escuro 
		Cuidado: Hidrazina é extremamente tóxico e cancerígeno. Além disso, formas anidra estes reagentes são explosivas. Como sempre, use capuzes PPE e emanações apropriados ao manusear. Não se concentrar essas soluções à secura.</li>
		<li>a esta solução, adicionar cerca de 5-10 mL de HCl concentrado para ajustar o pH a 2. Neste ponto, a solução será amarelo-marrom na cor.</li>
		<li>Calor esta solução a 105 ° C, agitando para 1-2 h. Um sólido amarelo irá precipitar fora da solução. Quando não mais visivelmente precipitar formas, retire do fogo.</li>
		<li>Permitir a mistura de reação para arrefecer à temperatura ambiente e em seguida, coloque em banho de gelo a 0 ° C por 10 min. recolher o sólido amarelo por vácuo filtração e lavagem com 5 mL de etanol e éter dietílico.</li>
		<li>Dissolver completamente o produto bruto em 15-25 mL de água quente. Fica frio 10 mL de uma solução de HCl concentrada em um frasco de filtro, colocando-o em um banho de gelo. Filtre a solução amarela para a solução de HCl refrigerada para induzir a precipitação de um sólido puro amarelo pálido. Esse precipitado de filtrar e lavar com 5 mL de HCl 0,5 M, etanol e éter.</li>
		<li>Caracterizar o composto usando espectroscopia de IR. Verificar a pureza pela identificação de alongamento as frequências de 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e 801 cm -1. Uma impureza comum menor em 2069 cm -1 é atribuída ao [Ru (NH 3) 5 N. 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Síntese de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>dissolver 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 em 50 mL de 1 M NH 4 OH em uma embarcação de pressão redondo de parede pesados de 200 mL. Vagamente tampar o frasco com uma rolha e aquecer a mistura de reação a 75 ° C, durante 6 h. Retire do fogo e misture à temperatura ambiente durante 4 dias produzir uma solução verde escura. 
		Cuidado! Um resultado de recipiente selado em um acúmulo de pressão de aquecimento. Certifique-se de usar produtos vidreiros de pressão-seguro apropriado. Para esta reação, a finalidade de selar o recipiente é minimizar a perda de gases NH 3. Portanto, coloque a rolha frouxamente para permitir a liberação do excesso de pressão.</li>
	</ol></li> <li>Purificação por cromatografia de permuta catiónica <ol><li>em uma proveta de 25 mL, suspender resina permutadora de catiões de 5 g (por exemplo, malha Dowex 50WX2 200-400 (formulário H +) em 10 mL de 0.1 M HCl.</li>
		<li>Carregar este chorume em uma coluna de 10 mL (10 mm de diâmetro, 15 cm de altura) afixado com um reservatório de solvente de 50 mL. Lave a resina com cerca de 20-30 mL de 0.1 M HCl, até que o eluído esteja incolor.</li>
		<li>Voltar para a solução de verde de reação isolada na etapa 1.2.1. Para esta solução, adicionar HCl concentrado para ajustar o pH a 2, no ponto em que a cor da solução muda para marrom.</li>
		<li>Carregar esta solução acidificada à coluna de resina permutadora de catiões, preparada na etapa 1.3.2 pipetando suavemente em cima da resina. Deixe o eluato completamente escorra e continuar a carregar a solução. Repita este processo até que toda a solução foi adicionada. O topo da resina será castanho escuro/preto. A resina irá diminuir volume ligeiramente.</li>
		<li>, Grânulos de vidro de uso para cobrir o topo da resina. Estas impedirá a resina de ser incomodado quando novas soluções são adicionadas.</li>
		<li>Eluir a coluna com 20 mL de 1 HCl, M.</li>
		<li>Eluir a coluna com uma maior concentração de HCl de 1,5 M (&#8776; 50 mL). Uma solução amarela começará a sair da coluna. Aumentar a concentração de HCl a 2 M e continuar até o eluato é incolor de eluição ou um verde-amarelo muito pálido. Um volume total de 150-200 mL serão necessário para este processo.</li>
		<li>Aumentar a concentração de HCl a 2,5 M (20-50 mL). Recolha o eluato em fracções em tubos de ensaio. Aumentar para 3 M HCl. O produto vai eluir da coluna como uma solução verde-marrom. Uma fração de vermelho-marrom também pode começar a sair da coluna. Como estas frações são impurezas oxidadas rutênio vermelho, não da piscina com as frações de verde-marrom.</li>
	</ol></li> <li>Caracterização e verificação de pureza de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>testar todas as frações de Passo 1.3.8. por espectroscopia UV-vis. Para realizar essa tarefa, adicionar 100 µ l de uma fração dada em 2 mL de 3 M de NH3 e analisar por espectroscopia UV-vis. Frações que contêm o produto puro terá uma banda grande absorvância a 360 nm e uma absorvância menos intensa em 600 nm. Absorvância a 480 ou 533 nm é indicativa de oxidado rutênio vermelho e impurezas de rutênio vermelho, respectivamente.</li>
		<li>Piscina frações contendo o produto puro e evaporar a solução para o ressecamento por evaporação rotativa. O produto será isolado como um sólido verde-marrom. Rendimentos são tipicamente da ordem de 5-15 mg (10-20% de rendimento). Single-cristais, apropriados para difração de raios x, podem ser obtidas através da difusão de vapor de etanol em solução aquosa do composto.</li>
		<li>Para verificar a pureza, analisar o composto por espectroscopia UV-vis em uma solução de pH 7,4 fosfato salino (PBS). Pureza pode ser avaliada tendo a relação de intensidade do 360 nm e 600 nm de picos. Esta proporção é 31 para um composto puro. Para compostos impuros, a proporção será menor.</li>
		<li>Analisar a amostra no estado sólido por espectroscopia de IR. Bandas de diagnósticos estão no 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bandas de impureza comum são vistas em 1762 cm -1 e 1400 cm -1, característico de NH 4 vermelho de rutênio CL pode ser identificado por bandas em 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Avaliação da inibição de absorção de cálcio mitocondrial por espectroscopia de fluorescência cuidado! Os procedimentos a seguir usam células de mamíferos. Trabalho deve ser efectuado em capas de adequado fluxo laminar que são certificadas para a segurança biológica de nível 2 (BSL2) pesquisa. 
	&#8203; Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 será referido como [Ru] nesta seção <ol><li>fazer buffer glicose contendo solução salina (BGSS) como a mídia de ensaio. BGSS é uma solução composta por 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, ácido de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 20 mM 4 (HEPES), succinato de sódio de 5 mM, 30 µM glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA). Combinam com tudo, exceto o EGTA, ajustar o pH para 7,4. Adicionar EGTA e reajustar o pH para 7,4. Para 50 mL de mídia de ensaio, adicionar 0,5 mL de glicose 1 mg/mL.</li>
		<li>Células HeLa cultura em 500 cm 2 placas de Petri em Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% soro bovino fetal (FBS) numa incubadora umidificado com 5% CO 2 a 37 ° C. amplificar as células HeLa crescendo em uma placa de Petri de 100mm por semeadura -os em um prato de petri de 2 500 cm. O volume total de mídia no prato grande é 115 mL. Cada prato grande produzirá cerca de 18 milhões células, suficiente para dois experimentos de espectroscopia de fluorescência.
		<ol><li>Crescer as células até atingirem 90-95% Confluencia. Remova a mídia e lave as células com PBS pH 7,4 de 15 mL. Adicionar 15 mL de ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS e incubar durante 10 min separar as células. Transferir as células para 14 mL redonda Falcão tubos</li></ol></li> <li>contar células usando trypan azul e um hemocytometer com um microscópio invertido e calcular o número total de células e o volume dos meios necessários para atingir 7,5 milhões de células por volume de 1,8 mL do meio. Centrifugar as células durante 10 minutos a 5310 × g. decantar o sobrenadante e adicionar o volume calculado de BGSS. Ressuspender as células suavemente.
		<ol><li>Para este ensaio, preparar soluções estoque de digitonin de 40 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), 1mm verde de cálcio-5N em H 2 O e 10 mM CaCl 2 em H 2 O. [Ru] Soluções conservadas em estoque, preparadas em água pura, pode variar de 1 a 3 mM. 
			&#8203; Nota: cálcio Green-5N é sensível à luz. Armazenar no escuro e minimizar a exposição à luz.</li>
		</ol></li> <li>Configurar o fluorímetro para excitar a 506 nm e leitura das emissões em 532 nm com a cubeta do titular controlada em 37 ° C. Prepare uma cubeta do acrílica com uma barra de agitação ou roda, suspensão de células de 1,8 mL de 1.5.2 acima, 1,8 µ l digitonin de solução, 3.6 & #181; L cálcio Green-5N (solução) e 9 µ l [Ru] (para solução estoque de 1 mM, concentração final de 5 µM). Incube as células durante 15 min no fluorímetro.
		<ol><li>Ler os dados como a relação de excitação/emissão, em vez da absorção bruta. Esta prática minimiza os erros associados com as flutuações da intensidade da fonte de luz.</li>
			<li>Análise da primeira amostra na ausência de [Ru] para medir o efeito da adição de CaCl 2 sobre a resposta das células.</li>
			<li>Begin análise sobre o fluorímetro com as configurações descritas na 1.5.4. Espere aproximadamente 2 minutos para estabelecer uma base estável de emissão e em seguida, adicionar 1,8 µ l de CaCl 2 (concentração final de 10 µM). A intensidade de emissão vai aumentar imediatamente após a adição do CaCl 2 e então irá decair ao longo dos minutos como os íons cálcio entram na mitocôndria. Esperar até que tenha terminado a decadência (&#8776; 5 min). Adicionar bolus de cálcio adicional para determinar a resposta de absorção de cálcio mitocondrial das células não tratadas com [Ru].</li>
		</ol></li> <li>Em uma outra cubeta contendo 5 µM [Ru], repetir a experiência, como descrito acima em 1.5.4.3. Na presença do inibidor, intensidade de emissão vai aumentar, mas não decadência. Esta observação significa que bloqueou a absorção de cálcio mitocondrial.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enjoy+the+trip:+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth.">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+calcium+connection.">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine.">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szab&#242;, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li><li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li><li>Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex.">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li><li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+component+of+"ruthenium+red"+responsible+for+inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport.+Spectra,+electrochemistry,+and+aquation+kinetics.+Crystal+structure+of+&#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of &#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2++Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes.">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360,+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake.">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li><li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+infrared+spectra+of+some+ammine+complexes+of+ruthenium(II)+and+ruthenium(III).">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+Ca&#8314;+uptake.">Assessment of mitochondrial Ca&#8314; uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

O cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 pode ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um ruthenium(III) bem conhecido começando o material, conforme descrito neste procedimento. A síntese de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 é facilmente alcançada com pouca dificuldade. Após agitação RuCl3 para 16 h na hidrazina hidrato, o pH da soluç?...

Cálcio mitocondrial é um regulador chave para um número de processos que são críticos para a função celular normal, incluindo apoptose e produção de energia. 1 , 2 , 3 o uniporter cálcio mitocondrial (MCU), uma proteína de transporte de íon que reside na membrana mitocondrial interna, regula o influxo de íons cálcio na mitocôndria. 4 , 5 , 6 químicos inibidores do MCU são ferramentas valiosas para continuar os esforços para estudar a função e funções celulares deste transporte de proteína e cálcio mitocondrial. O composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, é um dos único conhecidos inibidores seletivos para o MCU com um valor ded K relatado de 24 µM.7 ,8,9,10 , este complexo é uma impureza comum encontrada em comerciais formulações de rutênio vermelho (RuRed), um triruthenium di-µ-oxo em ponte hexacation da fórmula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que também tem sido usado como um inibidor de absorção de cálcio. Embora Ru360 seja disponível comercialmente, é muito caro. Além disso, a síntese e isolamento de Ru360 é desafiado por processos de purificação difícil e métodos de caracterização ambíguo.
Recentemente informamos procedimentos alternativos para acessar um Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este composto inibe a MCU com alta afinidade, semelhante ao Ru360. Neste protocolo, descreveremos nossa mais eficaz síntese deste composto, que se inicia a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificação do produto usando resina permutadora de catiões fortemente ácida é detalhada, juntamente com armadilhas comuns para este procedimento. Podemos também apresentar métodos para caracterização e avaliação da pureza de compostos e delinear uma abordagem simples para testar a sua eficácia em bloquear a absorção de cálcio mitocondrial.

<table><tbody><tr><td>Ruthenium Trichloride hydrate</td><td>Pressure Chemical</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated hydrochloric acid</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated ammonium hydroxide</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Succinate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Round bottom flask</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass stopper</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 15 cm glass column with reservoirs</td><td>Custom - similar to Chemglass columns</td><td>Similar to CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom Falcon tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; petri dishes</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Cuvettes</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Agilent Model Cary 8454&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimeter</td><td>SLM Model 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR spectrometer</td><td>Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ALC Model PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

synthesis and evaluation of a ruthenium-based mitochondrial calcium uptake inhibitor

Detalhamos a síntese e purificação de um inibidor de absorção cálcio mitocondrial,5 +[(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]. A síntese otimizada deste composto começa de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 em 1 M NH4OH em um recipiente fechado, produzindo uma solução verde. Purificação é realizada com a cromatografia de permuta catiónica. Este composto é caracterizado e verificado ser puro por espectroscopia UV-vis e IR. As propriedades inibitório de absorção de cálcio mitocondrial são avaliadas em pilhas HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescência.

Este método descreve uma síntese do cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um matérias-primas ruthenium(III) conhecidos. [Ru (NH3)5Cl] CL2 caracteriza-se por espectroscopia de IR, com modos vibracionais em 3200 cm-1, cm 1608-1, 1298 cm-1e...

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Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

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Research

JoVE Journal

Chemistry

7.8K visualizações.  Cornell University. Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.

Vídeo: Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

A Síntese, Caracterização e Reatividade de uma série de Rutênio<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Complexos

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

Química

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ability to accurately measure the influx and efflux of Ca2+ from mitochondria is important for determining the role of mitochondrial Ca2+ handling in these processes. In this report, we present two methods for the measurement of mitochondrial Ca2+ handling in both isolated mitochondria and cultured cells. We first detail a plate reader-based platform for measuring mitochondrial Ca2+ uptake using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. The plate reader-based format circumvents the need for specialized equipment, and the calcium green-5N dye is ideally suited for measuring Ca2+ from isolated tissue mitochondria. For our application, we describe the measurement of mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from mouse heart tissue; however, this procedure can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from other tissues such as liver, skeletal muscle, and brain. Secondly, we describe a confocal microscopy-based assay for measurement of mitochondrial Ca2+ in permeabilized cells using the Ca2+ sensitive dye Rhod-2/AM and imaging using 2-dimensional laser-scanning microscopy. This permeabilization protocol eliminates cytosolic dye contamination, allowing for specific recording of changes in mitochondrial Ca2+. Moreover, laser-scanning microscopy allows for high frame rates to capture rapid changes in mitochondrial Ca2+ in response to various drugs or reagents applied in the external solution. This protocol can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in many cell types including primary cells such as cardiac myocytes and neurons, and immortalized cell lines.

Here, we present two protocols for the measurement of mitochondrial Ca2+ influx in isolated mitochondria and cultured cells. For isolated mitochondria, we detail a plate reader-based Ca2+ import assay using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. For cultured cells, we describe a confocal microscopy method using the Ca2+ dye Rhod-2/AM.

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Bioquímica

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Bioengenharia

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the toxicokinetics of these compounds have both historical and modern-day relevance. Zebrafish have become an attractive model organism in elucidating pharmaco- and toxicokinetics in environmental exposure and clinical translation studies. Although zebrafish studies have the benefit of being higher-throughput than rodent models, there are several significant constraints to the model.
One such limitation is inherent in the waterborne dosing regimen. Water concentrations from these studies cannot be extrapolated to provide reliable internal dosages. Direct measurements of the metal-based compounds allow for a better correlation with compound-related molecular and biological responses. To overcome this limitation for metals and metal-based compounds, a technique was developed to digest zebrafish larval tissue after exposure and quantify metal concentrations within tissue samples by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS).
ICPMS methods were used to determine the metal concentrations of platinum (Pt) from cisplatin and ruthenium (Ru) from several novel Ru-based chemotherapeutics in zebrafish tissue. Additionally, this protocol distinguished concentrations of Pt that were sequestered in the chorion of the larval compared with the zebrafish tissue. These results indicate that this method can be applied to quantitate the metal dose present in larval tissues. Further, this method may be adjusted to identify specific metals or metal-based compounds in a broad range of exposure and dosing studies.

The increased rate of pharmaco- and toxicokinetic analyses of metals and metal-based compounds in zebrafish can be advantageous for environmental and clinical translation studies. The limitation of unknown waterborne exposure uptake was overcome by conducting trace metal analysis on digested zebrafish tissue using inductively coupled plasma mass spectrometry.

Absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Alterando a função mitocondrial para aplicações terapêuticas e bioinseticidas

Unveiling Xenobiotic Transport and Effects in Isolated Mitochondria: Insights from Respirometric and Enzymatic Assays

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). However, their significance extends far beyond energy production. Dysregulation of mitochondrial bioenergetics can trigger intracellular cascades that impact health and cellular function. Given their physiological importance, there is growing interest in exploring the pharmacological potential of mitochondrial function for developing new therapies and bioproducts. Modulating mitochondrial bioenergetics could provide innovative approaches to address challenges such as neurodegenerative disorders, metabolic diseases, and cancer, as well as to develop bioproducts for controlling pests and vector-borne diseases.
This work presents a method for assessing the effects of xenobiotics on the electron transport chain (ETC) using various substrates, including glutamate and NADH for complex I, succinate for complex II, and cytochrome c (both oxidized and reduced) for complexes III and IV. This methodology allows the activation or inhibition of electron transport through mitochondrial complexes to be evaluated using a respirometer and spectrophotometer. The mitochondria can be sourced from isolated mitochondria, fragmented cells, or homogenized tissue from various species.
In the laboratory, mitochondrial function has been analyzed in Aedes aegypti and Wistar rats, but this method is also applicable to other species, such as Rhipicephalus microplus and Rhodnius prolixus. This approach provides the basis for theorizing about the existence of uncoupler proteins and species-specific oxidizable substrate preferences influenced by their unique energetic demands. Recent findings offer valuable insights into innovative bioinsecticide design strategies that target mitochondrial function, holding significant potential for effectively controlling vector-borne diseases and pest infestations.

<meta charset="utf8"></head><body>Revelando o transporte e os efeitos xenobióticos em mitocôndrias isoladas: insights de ensaios respirométricos e enzimáticos

This study introduces a methodology for studying xenobiotic effects on mitochondrial function via respirometric and enzymatic assays. It examines electron transport chain modulation in various species, offering insights for targeted biopesticide development against insect vector-borne diseases.

Revelando o transporte e os efeitos xenobióticos em mitocôndrias isoladas: insights de ensaios respirométricos e enzimáticos

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in cytosolic Ca2+ buffering, and the ATP production in mitochondrial can be mediated by intramitochondrial free Ca2+ concentration. Ca2+ retention capacity can be regarded as the capability of mitochondria to retain calcium in the mitochondrial matrix. Accumulated intracellular Ca2+ leads to the permeability of the inner mitochondrial membrane, termed the opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which leads to the leakage of molecules with a molecular weight less than 1.5 kDa. Ca2+-triggered mitochondria swelling is used to indicate the mPTP opening. Here, we describe two assays to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+-triggered mitochondrial swelling in isolated mitochondria. After certain amounts of Ca2+ are added, all steps can be completed in one day and recorded by a microplate reader. Thus, these two simple and effective assays can be adopted to assess the Ca2+-related mitochondrial functions.

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

This protocol aims to describe a method to examine the Ca2+ retention capacity and Ca2+- triggered mitochondrial swelling of isolated mitochondria of SH-SY5Y cells step-by-step.

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Neurociência

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Biologia

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

Resumo

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Capítulos neste vídeo

A Síntese, Caracterização e Reatividade de uma série de Rutênio

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Um

Absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas

Revelando o transporte e os efeitos xenobióticos em mitocôndrias isoladas: insights de ensaios respirométricos e enzimáticos

Revelando o transporte e os efeitos xenobióticos em mitocôndrias isoladas: insights de ensaios respirométricos e enzimáticos

Revelando o transporte e os efeitos xenobióticos em mitocôndrias isoladas: insights de ensaios respirométricos e enzimáticos

Mitocondrial Ca^{2 +} retenção capacidade do ensaio e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente