Nosso grupo de pesquisa utiliza mitocôndrias como alvo farmacológico para o desenvolvimento de diferentes produtos como quimioterápicos, inseticidas, entre outros. Com este vídeo, queremos descrever a metodologia para avaliar enzimas da respiração mitocondrial de uma forma mais acessível, compreensível e utilizável. Em nosso laboratório, estabelecemos um protocolo para avaliar os diferentes efeitos dos xenobióticos nas mitocôndrias em ratos, mosquitos e carrapatos, fornecendo alguns insights sobre uma resposta mitocondrial específica.
Essa abordagem apóia a formulação de pesticidas biosseguros, identificando interrupções bioenergéticas mitocondriais críticas para minimizar a toxicidade não-alvo. Nossa vantagem diferencial inclui um protocolo de design de inseticida que começa com a análise in silico de milhares de moléculas, seguida pela validação in vitro daquelas que atendem aos critérios de biossegurança e termina com testes in vivo. Este método economiza tempo e recursos, ao mesmo tempo em que adere às melhores práticas na produção de pesticidas.
A médio prazo, selecionaremos moléculas de origem natural que podem ser combinadas com modificação genética, visando mitocôndrias de insetos, visando maior especificidade e biossegurança em organismos não-alvo. Para começar, prepare 250 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias com ou sem 0,2 gramas de BSA. Alíquota de 10 mililitros do tampão em um tubo cônico gelado.
Depois de sacrificar um rato, disseque seu fígado completamente e coloque-o no tampão de isolamento gelado para enxaguá-lo. Após duas lavagens, pique o tecido hepático com uma tesoura afiada em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de tampão de isolamento. Coloque a solução no tubo homogeneizador de tecidos Potter-Elvehjem para homogeneizar o tecido picado pelo menos 10 vezes a uma velocidade baixa de 390 rotações por minuto.
Em seguida, transferir a solução homogeneizada para um tubo cónico e centrifugar a 600 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação, despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo cônico. Centrifugar novamente o sobrenadante a 7 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius e rejeitar o sobrenadante resultante.
Ressuspenda o pellet mitocondrial isolado em dois mililitros de tampão de isolamento sem BSA. Verifique se os ovos de Aedes aegypti são eclodidos em bandejas com água desclorada filtrada uma semana antes do experimento e monitore o processo de muda nas larvas. Quando as larvas atingirem o estágio L3, aguarde no máximo 12 horas antes de coletá-las.
Usando uma pipeta Pasteur, colete pelo menos 100 larvas de Aedes aegypti nos instares L3 a L4 em aproximadamente 30 mililitros de água sem cloro. Após filtragem, transferir a solução com as larvas para o tubo homogeneizador de tecidos Potter-Elvehjem e homogeneizar cuidadosamente a cerca de 390 rotações por minuto, pelo menos 10 vezes. Transfira o tecido homogeneizado através de uma seringa de lã de vidro para filtrar grandes resíduos de exoesqueleto.
Para começar, obter mitocôndrias de fígado de rato e larvas homogeneizadas de Aedes aegypti L3, L4. Para ensaio polarográfico, calibre o respirômetro de alta resolução todos os dias antes de iniciar qualquer ensaio, seguindo as instruções do fabricante. Adicione meio de reação às câmaras, garantindo um excesso de pelo menos 0,2 mililitros acima do volume padrão da câmara experimental de dois mililitros.
Monitore o consumo de oxigênio para medir as atividades de NADH e succinato oxidase após adicionar tampão de reação, 0,1 miligramas de proteína e o substrato. Aguarde até que o sinal de concentração de oxigênio se estabilize e registre-o. Adicione inibidores de proteína de transporte de elétrons à câmara para confirmar que o consumo de oxigênio observado é devido à cadeia respiratória mitocondrial.
Para a atividade da NADH desidrogenase, primeiro prepare o sistema de reação contendo todos os componentes necessários e adicione os reagentes à célula do espectrofotômetro. Monitore a atividade da NADH desidrogenase com a redução do ferrocianeto de potássio a 420 nanômetros. Use o coeficiente de extinção molar de 1,04 por milimolar por centímetro para calcular a concentração.
Finalmente, divida a atividade relatada pela concentração de proteína usada para obter a atividade enzimática específica. Do mesmo modo, avaliar a succinato desidrogenase e a actividade da citocromo c redutase ou do complexo III, utilizando misturas de reacção adequadas. Para medir a atividade da citocromo c oxidase ou do complexo IV, prepare o sistema de reação e misture quantidades molares iguais de citocromo c e ditionito de sódio, garantindo a redução completa.
Passe a mistura reduzida por uma coluna de gel de dextrano reticulada usando o tampão fosfato como fase móvel. Quantificar as fracções recolhidas a 550 nanómetros num espectrofotómetro. Por fim, calcule a concentração com um coeficiente de extinção molar de 19,8 por milimolar por centímetro, aplicando a lei de Beer.
Divida a atividade relatada pela concentração de proteína para resultados de atividade enzimática específica. O cavacrol a 9,7 partes por milhão reduziu a atividade da NADH oxidase em aproximadamente 9,35%, enquanto o óleo essencial de Cymbopogon flexuosus, ou EO, a 10 partes por milhão reduziu a oxidação do NADH e a redução de oxigênio em cerca de 34%, indicando inibição no transporte de elétrons entre o Complexo I e o Complexo IV. e Cymbopogon flexuosus EO reduziu a atividade da succinato oxidase em até 50% nas mitocôndrias isoladas do fígado de rato, sugerindo uma inibição entre o Complexo II e o Complexo IV.
