Name: preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography at JoVE.com

This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

Cuidado: Consulte as fichas de segurança (MSDS) dos vários reagentes antes de usá-los. Vários dos produtos químicos utilizados durante a preparação da amostra são tóxicas, cancerígenas, mutagénicas e / ou tóxicas para a reprodução. Use equipamento de protecção individual (luvas, jaleco, calças compridas e sapatos fechados) e trabalhar sob um exaustor durante o manuseio da amostra. Seccionamento da amostra com um ultramicrotome envolve o uso de instrumentos cortantes, e uso cuidadoso dessas ferramentas é obrigatória. Nos passos descritos abaixo, os autores assumem que a amostra é uma amostra de cultura de células. O protocolo pode necessitar de ser modificada de acordo com o tipo de amostra, especialmente os passos de centrifugação. 1. Preparação de buffers e misturas <ol><li> Preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, e 1,76 mM de KH 2 PO 4). </li><li> Preparar soluções contendo 30%, 50%, e 70% de Ethanol em PBS durante a desidratação amostra. Realizar a desidratação da amostra por incubação da amostra gradualmente em concentrações crescentes de etanol. </li><li> Prepare resina epoxi misturando bisfenol-A- (epicloridrina) (20 mL), anidrido succínico dodecenilo (9 mL), metil-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (11 mL), e 2,4,6-tris ( dimetilaminometil) fenol (0,7 mL); outras proporções de mistura pode ser utilizado, dependendo da dureza desejada da resina. </li><li> Preparar soluções contendo 30%, 50%, e a resina epóxi 70% em etanol para a incorporação da amostra. Realizar a incorporação da resina por incubação da amostra gradualmente com o aumento das concentrações de resina. NOTA: Os volumes das soluções preparadas dependem do tipo de amostra que é estudada. Mais soluções são necessários para os tecidos do que para as culturas celulares. </li></ol> 2. Fixação e coloração da Amostra <ol><li> Centrifugar a cultura de células durante 5 min a 5000 x g. Realiza todas as seguintes centrifugações, usando as mesmas condições.</li><li> Descartar o sobrenadante e fixar o sedimento de células por ressuspensão em PBS que (1 mL) com 4% de paraformaldeído e glutaraldeído 2%. Incubar-la à temperatura ambiente durante 30 min (Figura 1A). Em alternativa, fixar as células a 4 ° C durante a noite ou no fim de semana. </li><li> Após centrifugação, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de 3 vezes com PBS (1 mL) para eliminar completamente os agentes fixadores. </li><li> Pós-fixar a amostra com 1% de OsO 4 em PBS (1 mL) durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de 3 vezes com PBS (1 mL) para se remover completamente o OsO4. Desactivar o OsO 4 em óleo e descarte. </li><li> Adicionar 2% de acetato de uranilo em PBS (1 ml) como agente de contraste e incubar a amostra durante 30 minutos à temperatura ambiente (Figura 1B). </li><li> Após centrifugação, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de 3 vezes com PBS (1 mL) para remover o ac uranilo não ligadoetate; acetato de uranilo contém elementos radioativos e devem ser eliminados de uma bin dedicado aos resíduos radioactivos. NOTA: Os tempos de incubação podem ser modificados de acordo com o tamanho da amostra. Por exemplo, fixação e coloração das amostras mais espessas, tais como amostras de tecidos, requerem tempos de incubação mais longos. tempos de incubação mais longos podem também ser melhor para a desidratação e os passos de incorporação. acetato de uranilo pode ser substituída por uma solução &quot;de uranilo-menos&quot; que contém sais de gadolínio. </li></ol> A desidratação 3. Amostra <ol><li> Após centrifugação, desprezar o sobrenadante e incubar a amostra durante 30 min a 4 ° C em PBS (1 mL) com etanol a 30% (Figura 1C). </li><li> Repetir o passo 3.1 utilizando soluções com concentrações gradualmente crescentes de etanol (50%, 70%, e até 100%). Durante estes passos de desidratação, manter a amostra a 4 ° C para fins de conservação das amostras. </li><li> Após a centrifugação, descartar o Supernatformigas e ressuspender o sedimento em etanol puro (1 mL); incubar durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 4. Resina Embedding <ol><li> Após centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em etanol com 30% de resina epoxi (1 mL) durante 30 min à temperatura ambiente (Figura 1D). </li><li> Repetir o passo 4.1 utilizando soluções com concentrações de resina epoxi gradualmente crescente (50%, 70%, e até 100%). </li><li> Após centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em resina epóxi puro (1 mL); incubar durante a noite à TA. A presença de endurecimento DMP-30 pode desencadear a polimerização da resina; Se isso acontecer, preparar dois lotes de resina epoxi, um com e um sem DMP-30. </li><li> Após centrifugação, ressuspender o sedimento em 200 ul de resina epóxi pura (contendo o endurecedor) em uma cápsula de plástico; a amostra deve estar na parte inferior da cápsula de plástico. </li></ol> 5. Resina de polimerização <ol><li> Euncubate a cápsula de plástico contendo a amostra numa incubadora a 60 ° C durante 48 h; outros tipos de resina pode polimerizar com configurações diferentes. </li><li> Remover a cápsula da incubadora e verificar que a resina tenha polimerizado; a resina deve ser difícil se pressionado contra uma superfície dura. </li><li> Adicionar resina epóxi pura (contendo o endurecedor) no topo da resina polimerizada que contém a amostra; Esta camada extra de resina vai torná-lo mais fácil de cortar a amostra. Incubar a cápsula a 60 ° C durante 48 h. </li></ol> Seccionamento 6. Amostra <ol><li> Monte a amostra de cabeça para baixo em um suporte de amostra, de modo que a amostra é em direção ao topo e corrigi-lo no bloco de corte do ultramicrotome. Firmemente bloquear a alavanca para fixar o bloco de corte ao ultramicrotome. </li><li> Usando uma lâmina de barbear ou de um instrumento de corte afiada semelhante, cortar a cápsula de plástico para separá-lo a partir da resina polimerizada. Cortar a resina de modo que a amostra é conterEd na resina em aproximadamente a forma de uma pirâmide. Não há necessidade de remover toda a cápsula de plástico; só remover a parte que cobre a amostra polimerizada. </li><li> Tome a cápsula e o suporte de amostras fora do bloco de corte e instalá-los no braço móvel da ultramicrotome. </li><li> Instalar uma faca corte no bloco faca e cortar com precisão as faces da pirâmide. O uso de binóculos é aconselhado a dar uma forma perfeita para a pirâmide; o melhor da pirâmide, melhor as seções será. </li><li> Retire a faca de corte e substitui-lo com uma faca histologia que pode ser usado para cortar secções que são mais espessas do que 0,5 um. </li><li> Após o enchimento da cuvete da faca histologia com a quantidade correcta de água, trazer a aresta de corte da faca à superfície da amostra e usar o binóculo para ajustar o ângulo de passo da cápsula de modo que a faca irá cortar perpendicularmente à pirâmide. </li><li> Ajustar a velocidade de corte de acordo com o pretendidoespessura de corte para recuperar seções homogêneas. </li><li> Deixe o flutuador seção sobre a água e pescá-lo com um loop. </li><li> Mover o ciclo no sentido de uma grelha de cobre de microscopia electrónica que foi colocado em cima do papel de filtro. NOTA: A grade deveria ter sido previamente tratados para aumentar a sua hidrofilicidade. Isto pode ser realizado com uma caneta de revestimento grade. </li><li> Devido à absorção de água pelo filtro de papel, deixe a secção de manter o grid. Deixe secar por alguns minutos antes de inseri-lo no microscópio eletrônico. </li></ol> 7. Desenho do meio-focal Tilt-series <ol><li> Recolher imagens através focais em intervalos foco constante. NOTA: A inclinação da série através de-focal consistem em um conjunto de imagens através focais que são coletados em cada ângulo de inclinação da série de inclinação. Toda a amplitude foco deve ser suficiente para cobrir toda a espessura da amostra. </li><li> Determinar o valor do intervalo de foco. Se o intervalo é igual a d oepth de campo, recolher toda a amostra em foco; esta configuração representa a mais alta de amostragem possível. Se o intervalo é maior do que a profundidade de campo, algumas partes da amostra não será adquirida em foco, o que significa que algumas partes da amostra não irá ser recolhido em foco. </li><li> Calcula-se a profundidade de campo de um feixe de electrões de comprimento de onda do electrão e o semi-ângulo de convergência do feixe de electrões. Considerando que o comprimento de onda dos electrões está directamente ligada à voltagem de aceleração, utilizar o semi-ângulo de convergência fornecida pelo fabricante microscópio de electrões ou determinar experimentalmente a partir do padrão de difracção de uma amostra de 16 conhecido. Porque os elétrons acelerados a um λ comprimento de onda atingiu a amostra com uma convergência semi-ângulo de α em um microscópio eletrônico, use a seguinte equação para determinar a profundidade de campo-(DOF): <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> desenhara série focal de modo que toda a amplitude foco vai cobrir a amostra na sua espessura aparente máxima (isto é, na sua maior inclinação). NOTA: Uma amostra de 0,75 um de espessura terá uma espessura aparente de 2,19 uM a uma inclinação de 70 °, de modo que a amplitude foco deve ser maior do que 2,19 | im. Para este exemplo, se o intervalo de focagem acima determinado é igual a 50 nm, será necessária imagens 44 (2,19 ^ M / 50 nm) para cobrir a amostra na sua espessura máxima aparente. Toda a amplitude do foco é igual ao valor do intervalo de foco multiplicado pelo número de passos focais. Na maior inclinação (θ), a espessura aparente da amostra é definido como o seguinte: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> Imagem 8. Amostra NOTA: é para além do âmbito deste protocolo para descrever como configurar um microscópio eletrônico no modo STEM; a maioria desta informação pode ser encontrada in o manual de referência fornecido pelo fabricante do microscópio eletrônico. No entanto, observe o seguinte: i) o tamanho do ponto deve ser escolhido de acordo com a ampliação desejada; ii) o Ronchigram deve ser bem alinhados; e iii) no modo de BF, o comprimento da câmara deve ser ajustado para seleccionar electrões não dispersa mantendo ao mesmo tempo uma boa iluminação do detector. secções de resina depositados em grades de cobre de microscopia eletrônica deve ser iluminado antes de aquisição de imagem para evitar o encolhimento. encolhimento resina e efeitos de carregamento pode ser confundido durante a aquisição de imagem. O uso de uma abertura lente objetiva pode melhorar a estabilidade da amostra quando ocorrem efeitos de tarifação. No entanto, no caso específico de configurações STEM, a abertura objectivo não é compatível com o modo de imagem HAADF, e muito pequenas aberturas objetivos não são compatíveis com o modo de imagem BF. <ol><li> Usando baixa ampliação (cerca 20,000X em STEM), navegue através da amostra e localizar a região de interesse. </li><li> Ajuste tele eucentric altura (eixo Z), de modo que a região de interesse não se afastam enquanto se rodam a amostra. </li><li> Verifique se o objeto de interesse permanecerá visível em toda a faixa de inclinação. </li><li> Devido ao número substancial de imagens adquiridas durante uma tilt-série através de-focal, use um software de coleta automática. Ou usar uma solução comercial ou projetar um software de coleta de dados personalizado, se desejar. Certifique-se de que o programa de software é capaz de executar os três passos que se seguem: <ol><li> Rastrear e focar como em um esquema padrão de coleção da série de inclinação. </li><li> Certifique-se de que as imagens através focal-se sobrepõem com o Z-posição da amostra. </li><li> adquirir automaticamente uma série de imagens através de-focal em cada ângulo de inclinação. </li></ol></li><li> Dê o programa de software os principais parâmetros da série de inclinação por meio-focal (ou seja, intervalos focais, etapa focal, ângulo mínimo de inclinação, ângulo de inclinação máxima, o passo de inclinação e velocidade de varredura). </li><li> Começaro processo de recolha de imagem e esperar que o programa de software para terminar. </li></ol> Processamento 9. Imagem NOTA: Neste protocolo, o processamento da série de inclinação por meio-focal é realizada utilizando ImageJ plugins 17. Dados Suplementar 1 mostra um macro ImageJ para a etapa de alinhamento (Turboreg) e para mesclar informações em foco (profundidade de campo estendida) para um tilt-série através de-focal projetado com três valores de foco. <ol><li> Alinhe as imagens recolhidas no mesmo ângulo de inclinação (isto é, as imagens através focais). Desde imagens não têm a mesma informação em foco, eles não abrigam as mesmas características de alinhamento; realizar o alinhamento, alinhando imagens vizinhos dois a dois (ou seja, seguindo uma hierarquia piramidal, com os valores mais próximos concentrar primeiro) usando Turboreg 18, um plugin do ImageJ. </li><li> Consistentemente verificar o alinhamento das imagens através focais em cada ângulo de inclinação.Empilhar as imagens através focais alinhados para melhorar a inspeção visual. NOTA: Somente a zona que está em foco deve mover-se enquanto navega através da pilha. alinhamento preciso é a coisa mais importante, uma vez que o passo seguinte consiste na recuperação da informação que está em foco a partir de imagens diferentes. </li><li> Mesclar as informações que está em foco usando Depth of Field estendida 19, um plugin do ImageJ; este acabará por gerar uma única imagem a partir da pilha de imagens. Várias configurações podem ser usadas durante a recuperação da profundidade de campo, mas use as configurações mais altas para preservar as informações da imagem. NOTA: A série de inclinação é agora composta por uma única imagem por ângulo de inclinação, cada imagem contém a informação em foco recuperado das imagens através focais. </li><li> Processar os dados. NOTA: ferramentas padrão para alinhamento e reconstrução podem ser usados ​​desde que os dados agora foi reduzido a uma série de inclinação padrão. Neste protocolo, TomoJ nós éed para o alinhamento de dados e reconstrução de dados 20, 21. Mais detalhes sobre como usar TomoJ pode ser encontrada na publicação original 22. </li><li> Executar bem o alinhamento da série de inclinação. NOTA: Uma boa estratégia é usar contas de ouro como marcadores fiduciais de controlar com precisão mudanças entre imagens. mínimos locais pode também ser usado se contas de ouro não pode ser adicionada à amostra. </li><li> Executar uma reconstrução 3D dos dados alinhados; vários algoritmos estão disponíveis para executar as reconstruções no espaço real ou espaço de Fourier, cada um com vantagens e limitações. </li><li> Se o alinhamento final da série de inclinação é pobre, fazer algumas melhorias, otimizando os passos iniciais. Reiterar as etapas de alinhamento se a reconstrução 3D última parece desfocada ou deformada; Na prática, quanto maior for o número de planos focais recolhidos, melhor será o contraste e os detalhes da reconstrução 3D. NOTA: Several programas de software pode ser utilizado para processar a inclinação-série por meio-focal. No entanto, as ferramentas utilizadas neste protocolo foram escolhidos porque, em nossa experiência, eles tiveram o melhor desempenho. Turboreg 18 tiveram melhor desempenho em termos de alinhamento das imagens, quando um gradiente de foco esteve presente. Mais informações podem ser encontradas no site dedicado 23. A profundidade de campo estendida plug-in 19 um desempenho muito bom em termos de recuperar a informação em foco a partir de imagens diferentes, ao passo que outras ferramentas resultaram em modificações pixels visíveis. Mais informações, especialmente em relação escrita de argumentos, podem ser encontradas neste site dedicado 24. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy.">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041 (2016).</li></ol>

We have no conflict of interest to disclose.

Neste artigo, apresentamos um protocolo de preparação da amostra convencional, juntamente com um guia passo-a-passo para a realização de análise 3D em amostras biológicas de espessura usando STEM tomografia meio-focal. Resina incorporação de espécimes biológicos tem sido usado por décadas 26 e protocolos alternativos que são adaptados a diferentes tipos de amostras podem ser encontrados em toda a literatura 27. Em contraste, a imagem espécimes de espessura em ...

Desde o início da década de 1970, a tomografia abordagens em microscopia electrónica de transmissão (MET) têm sido amplamente utilizados para a caracterização estrutural de espécimes biológicos 1, 2, 3. O recurso de tomografia electrónico de transmissão mostrou que poderia ser usado para estudar uma vasta gama de estruturas biológicas em escala nanométrica, a partir da arquitectura das células e a ultra-estrutura de organelos para a estrutura dos complexos macromoleculares e as proteínas. No entanto, a tomografia electrónica de transmissão não pode ser usado para estudar amostras muito espessos (mais do que 0,5 micron). De fato, as amostras de espessura produzir muitos elétrons dispersos, gerando imagens de baixa relação sinal-ruído (SNR). Além disso, a tomografia envolve a recolha de imagens de espécimes inclinado, com a espessura aparente da amostra aumenta com o ângulo de inclinação. Apesar de dispersão não elástica pode ser filtradausando filtros de energia, a quantidade crítica de elétrons necessários para imagens de alta SNR é mal chegou na TEM. Assim, amostras biológicas de espessura única têm sido estudados utilizando seccionamento 4. Algumas amostras não pode ser cortado: alguns podem degradar quando são cortadas, e outros precisam ser estudados na sua totalidade, a fim de compreender a sua complexidade. Uma abordagem alternativa é usar TEM no modo 5, 6, 7, 8 digitalização. Em microscopia de varrimento electrónico de transmissão (STEM), o percurso óptico de electrões é diferente do que no TEM convencional. Os electrões passam através da amostra sem dispersão pode ser recolhida no eixo óptico com um de campo claro (BF) detector de 9, ao passo que as dispersa elasticamente podem ser recolhidos a um certo ângulo a partir do eixo óptico com um detector de campo escuro (DF).A outra vantagem da haste é que o feixe de electrões focado é digitalizado na superfície da amostra, permitindo a recolha de pixel-a-pixel da imagem. Mesmo que o feixe de electrões expande ao passar através da amostra 10, este sistema de recolha em particular é menos sensível aos electrões inelasticamente dispersos do que MET convencional. Além disso, não há nenhuma lente de pós-espécime em STEM, evitando-se assim as aberrações cromáticas que podem ocorrer em MET. O comprimento da câmara pode ser ajustado de modo que o detector detecta BF principalmente electrões não dispersa. Usando o detector DF para estudar amostras de espessura não é recomendado por causa da dispersão múltipla, que produz imagens imprecisas. Em vez disso, o detector pode ser usado BF 11. Enquanto STEM pode produzir imagens de alta SNR, tem uma relativamente baixa profundidade de campo por causa da convergência relativamente elevado feixe comparação com TEM, diminuindo a quantidade de informações detalhadas que podem ser recuperados a partir de espessuraespécimes. No caso dos microscópios STEM corrigiu-aberração, onde o ângulo de convergência pode ser tão alta quanto 30 mrad, a profundidade de campo-pode ser baixa o suficiente para que a informação que está em foco origina de um plano focal de apenas alguns nanômetros . Configurando o feixe de elétrons em modo paralelo aumenta a profundidade de campo do feixe de elétrons em detrimento da resolução 12. No entanto, esta configuração não é sempre possível. Sempre que é necessário utilizar um feixe de electrões convergente, deve-se usar técnicas que melhoram a profundidade de campo do feixe de electrões quando estudar amostras grossas. Estudos recentes têm relatado a aquisição de imagens múltiplas em vários planos focais em toda a amostra para recuperar o máximo de informações em foco 13, 14. Os dois estudos descrevem maneiras diferentes de lidar com as informações dos diferentes planos focais. Hovden et ai.combinado no espaço Fourier das imagens que foram recolhidos em vários planos focais, ea reconstrução final foi obtido directamente a partir da inversa 3D transformada de Fourier 13. Em contraste, Dahmen et ai. desenvolveu um motor de reconstrução feixe convergente para reconstruir no espaço real o volume 3D dos vários planos focais 14. O nosso laboratório também desenvolvido um método para imagiologia de espécimes biológicos grossas. Nossa estratégia era diferente dos dois métodos descritos acima, em que fundiu as informações que está em foco nos vários planos focais e reconstruído o volume 3D final em espaço real usando um projetor de feixe paralelo 15. O nosso objectivo foi desenvolver um método que pode ser facilmente realizado em qualquer laboratório microscopia electrónica. Para este fim, o nosso objectivo de recolher as imagens focais em uma quantidade limitada de tempo, comparável com o período de tempo de experimentos de tomografia convencionais. Além disso, o nosso método proposto could ser adaptada para uso com diferentes tipos de software de alinhamento e de reconstrução. No contexto da nossa publicação a partir de 2015 15, que queria para visualizar e caracterizar a recuperação da profundidade de campo, por isso usamos uma grande convergência semi-ângulo de 25 mrad. Aqui, nós apresentamos um protocolo passo-a-passo para a execução através de imagiologia-focal em espigão de acordo com o método desenvolvido no nosso laboratório em 2015 15, e que apresentam a forma como os dados a partir de 2015 foi processada. Este método recupera informação de focagem a partir de vários planos focais ao longo de um (750 nm) da amostra biológica de espessura e permite reconstruções 3D de alta qualidade. Se for caso disso, as diferenças de metodologia em relação aos métodos utilizados por outros grupos também são apresentados.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxyde</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Capsule</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Triming and Histo knives</td><td>LFG Distribution</td><td>Diatome diamond knives</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy copper grid</td><td>LFG Distribution</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Grid Coating Pen</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Holder</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Em nosso estudo, os elétrons foram acelerados a 200 kV na emissão de campo microscópio eletrônico de transmissão arma. As imagens foram coletadas no modo STEM BF usando um tempo de permanência de 20 uS. Quanto ao design do tilt-série através de-focal, descobrimos que os intervalos de focagem de 150 nm deram resultados satisfatórios para o estudo ultra-estrutural de uma amostra-even 750 nm de espessura biológica que a profundidade de campo-do feixe de elétrons foi apenas 3 nm-d...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K visualizações.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

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Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of the woodboring beetle, Chlorophorus caragana Xie &#38; Wang (2012), for both types of electron microscopy. The scanning electron microscopy (SEM) sample preparation protocol was based on sample chemical fixation, dehydration in a series of ethanol baths, drying, and sputter-coating. By adding Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) to the fixative and the wash solution, the insect body surface of woodboring beetle was washed more cleanly in SEM. This study&#39;s transmission electron microscopy (TEM) sample preparation involved a series of steps including fixation, ethanol dehydration, embedding in resin, positioning using fluorescence microscopy, sectioning, and staining. Fixative with Tween 20 enabled penetrate the insect body wall of woodboring beetle more easily than it would had been without Tween 20, and subsequently better fixed tissues and organs in the body, thus yielded clear transmission electron microscope observations of insect sensilla ultrastructures. The next step of this preparation was determining the positions of insect sensilla in the sample embedded in the resin block by using fluorescence microscopy to increase the precision of target sensilla positioning. This improved slicing accuracy.

In order to observe ultrastructure of insect sensilla, scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM, respectively) sample preparation protocol were presented in the study. Tween 20 was added into the fixative to avoid sample deformation in SEM. Fluorescence microscopy was helpful for improving slicing accuracy in TEM.

Método de preparação de amostras de microscópio eletrônico de varredura e transmissão para os apêndices do Besouro Woodboring

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...

Ambiente

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Engenharia

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Bioengenharia

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biologia

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

Fluxo de trabalho de tomografia de array para a aquisição direcionada de informações de volume usando microscopia eletrônica de varredura

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Uma descrição cartográfica 3D da célula por crioma tomografia de raios-X suave

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryo-STEM tomography provides a means to visualize organelles of intact cells without embedding, sectioning, or other invasive preparations. The 3D resolution obtained is currently in the range of a few nanometers, with a field of view of several micrometers and an accessible thickness in the order of 1 &#181;m.