Name: application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

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	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. 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The authors declare they have no competing financial interests.

Nós descrevemos o uso de barreiras impermeáveis ​​para evitar a formação de gemas membros no embrião de galinha. Esta técnica tem uma série de passos críticos. Na sequência de experimentos preliminares, descobrimos que as barreiras em forma de articulação utilizados em 9, 10 permanecem no local no embrião muito melhor do que as barreiras retas. O lado distal plana da barreira adere à membrana vitelina e mantém a barreira no lugar (Figura 2C). A preparação cuidadosa da charneira em forma de barreiras de folha de alumínio, tal como descrito na etapa 1.6 protocolo é essencial para o sucesso da operação. Um segundo passo importante é garantir que os ovos não são deixados de fora da incubadora por muito tempo seguinte janelas e estadiamento antes de operar sobre o embrião. Na nossa experiência, os embriões sobreviver a uma operação de melhor se eles estão em ou perto da temperatura de incubação quando a operação é realizada. Operações devem ser realizadas o mais rapidamente possível e os ovos resealed prontaly para garantir boas taxas de sobrevivência. Muitos investigadores adicionar uma gota de antibióticos para o embrião seguinte microcirurgia antes de devolver os ovos à incubadora. A presença do líquido impedido as barreiras de furar também em posição. A adição de antibióticos também pode desalojar grânulos após a colocação. Portanto, não utilizando antibióticos, operações rápidas e boa limpeza com instrumentos é recomendado para evitar a infecção. Limpando instrumentos com 70% de etanol seguindo todas as fases de uma operação é essencial para evitar que instrumentos se torne pegajoso do contato com a membrana vitelina que pode causar ambas as barreiras ou contas de aderir a uma pinça (veja o passo protocolo 3.1.2.2). Ambas as variedades de contas utilizadas poderia cair fora do lugar após a operação. Quando a posição de barreira foi verificada no dia seguinte, não foi possível ver através da barreira de verificar se o talão permaneceu no local ou não. Nos casos em que o talão tinha caído para fora da asa bud crescimento não foi resgatado ( <strong&gt; Tabela 1). Evitando a transferência de líquido com o talão quando implantá-las significa que as contas ficar mais facilmente à superfície do corte da LPM (ver protocolo 2.3.2.3). Por último, assegurando que os embriões são corrigidos imediatamente após a colheita é fundamental para uma boa análise de expressão gênica subsequente (veja o passo protocolo 4.2). Este protocolo modifica experiências publicadas anteriormente que usaram barreiras para impedir que membros de iniciação broto, define as larguras ideais específicas para barreiras e introduz combinando barreira e talões seguido por análise de expressão gênica. Encontrámos utilizando folha de alumínio convencional, que é barato e facilmente disponível em todos os laboratórios, produz resultados iguais aos que anteriormente utilizado folha de tântalo. A folha pode ser deixado no embrião aquando da realização de hibridização in situ (Figura 2C &#39;), mas que normalmente se removê-lo mais do que um embrião está a ser processado para evitar que as arestas da folha de danificar embriões. PIlot estudos demonstraram que a largura de perna barreiras região é particularmente importante. Inicialmente, as barreiras testadas eram muito curtos e crescimento perna bud não foi evitado. 1,2-1,3 mm é a largura ideal para uma barreira para bloquear conseqüência bud perna completamente. As barreiras asa mais estreitos que se pode colocar com precisão para evitar a conseqüência bud dar as melhores taxas de sobrevivência. Isto pode ser tão estreito quanto 0,5-0,7 mm. No entanto, as barreiras que são um pouco mais amplo são mais propensos a resultar em bloqueio completo da asa bud crescimento porque permitem um pouco de imprecisão de colocação (que usamos 0,7-1 mm). Prevenção de vasos sanguíneos ao fazer a incisão é fundamental para níveis de barreira à asa bud. barreiras semipermeáveis ​​têm sido utilizados anteriormente para bissetriz do broto de membro do pintinho. MacCabe e Parker, 1976 e Summerbell, 1979 filtros utilizados tanto de 0,45 um e 0,8 um de tamanho de poro, respectivamente 16, 17. Eles relataram que os sinais difusíveis pode passar através dos poros dos filtros e queresultados obtidos com barreiras semi-permeável foram a meio caminho entre um broto de membro com nenhuma barreira de presente e um com uma barreira de folha de tântalo impermeável. Este protocolo poderia ser adaptado para utilizar as barreiras semi-permeáveis ​​de diferentes graus de tamanho de poro para diferenciar sinais de candidatos com base no tamanho ou para modificar a dinâmica de difusão de sinal. Este protocolo tem várias limitações, principalmente associados ao modelo próprio organismo. Tais técnicas podem ser usadas para sondar mais perguntas em desenvolvimento dos membros e também outras questões de embriogênese dos vertebrados. A condição é que o órgão / área em questão deve desenvolver quando o embrião de galinha é acessível a intervenção. A presença de grandes vasos sanguíneos na área onde uma barreira necessita de ser colocado torna a colocação de barreira mais tarde do que a fase 13 ou 14 de um desafio técnico. Se grandes vasos sanguíneos são cortadas durante a colocação do obstáculo que isto poderá causar mortalidade embrionária. A nossa investigação de quando os factores de transcrição TBX5 e Tbx4 são primeiro induzida no LPM foi limitada pela fase mais próxima em que se pode colocar uma barreira que, mais tarde, acabam oposto, quer a asa ou broto perna, respectivamente. Pode ser esclarecedor para tentar bloquear a indução do gene Tbx em fases anteriores, mais perto de gastrulação. O mais antigo de uma barreira pode ser colocada na região da asa presuntivo foi com sucesso fase 8 e na fase região perna 10. Este protocolo não é provavelmente adequado para o estudo da expressão do gene para além fases brotos de membros, porque o crescimento rápido subsequente deslocaria a barreira e resultados incidiria apenas para a posição inicial da barreira. Tendo relatado as limitações do embrião de pinto, neste contexto, as suas vantagens sobre outros organismos modelo de vertebrados são muitas. O embrião de galinha é um modelo animal bastante adequado para este tipo de intervenção física num embrião de vertebrado. Os embriões são relativamente grandes e são facilmente acessíveis atragh casca do ovo. Pode-se voltar para o embrião para experimentação adicional (por exemplo, a retirada de um talão 18 ou mesmo uma barreira) ou para verificar o progresso simplesmente removendo a fita janela. Não é possível escopo para incluir imagens ao vivo ou imagem lapso de tempo. Nós descrevemos um método de janelamento ovos de galinha que é particularmente adequado para operar em embriões em estágio inicial. No caso de estudos de membros é muito importante e útil que não é um membro contralateral de controlo para cada experimento que serve como um controlo interno ideal para cada réplica biológica. A combinação do uso de barreiras impermeáveis ​​para impedir a excrescência do membro e grânulos embebidos em moléculas de sinalização não foi relatada antes. A nossa análise da expressão de mRNA na sequência de tais intervenções também é romance. Estas técnicas nos permitiu dissecar o difícil problema de quando membros de transcrição específico fatores Tbx5 e Tbx4 são induzidas na LPM e tambémpara mostrar que, mais tarde, antes da iniciação limb bud, a presença desses genes TBX no LPM não é suficiente para a activação de FGF10 de transcrição e o início do crescimento de brotos de membros. Figuras 2G, 2D e 2E ilustram estas conclusões bem. A ausência de expressão Tbx4 após a inserção de uma barreira na fase 10 na figura 2G está em contraste com a sua presença em 2D e 2E após a inserção de barreira na fase 15, após a indução da Tbx4. A implantação de contas RA embebido facilitou o resgate do membro de iniciação bud após a inserção de barreira e então aponta para RA de somitos sendo essencial na LPM antes de brotos de membros conseqüência pode começar. Tais técnicas podem ser usadas para resolver outras questões no desenvolvimento dos membros, mas também outras questões de embriogênese dos vertebrados. Áreas do cérebro, olho e do tronco são susceptíveis de ser adequado.

embriologistas clássicos tradicionalmente empregadas técnicas físicas para interrogar os mecanismos que controlam o desenvolvimento embrionário. Nos anos 1960 e 1970, os investigadores desenvolveram técnicas que usaram barreiras impermeáveis ​​inseridos entre tecidos do embrião em desenvolvimento para demonstrar a importância de sinais indutores durante a embriogênese. Nosso interesse é o desenvolvimento dos membros de vertebrados e, em particular, os eventos que precedem membro bud crescimento. Por exemplo, a inserção de uma barreira pode impedir brotos de membros crescimento ocorra de um lado do embrião de galinha, enquanto que lhe permita continuar normalmente sobre o lado contralateral não operado. Os materiais utilizados para fazer essas barreiras variada; por exemplo, placas de mica 1 e tântalo folha 2. Estas barreiras eficazmente separar a mesoderme lateral (LPM), a partir do qual as formas de brotos de membros, dos somitos formada a partir da mesoderme paraxial. técnicas de enxerto cirúrgico demonstram que perto sagacidade associaçãoh somitos é essencial para a iniciação brotos de membros é que ocorra no LPM 3 4. Nos anos 80 e 90 biólogos do desenvolvimento descobriu difusível moléculas que são essenciais no controle de processos de desenvolvimento sinalização. Grânulos embebido com essas moléculas de sinalização pode ser implantado em regiões específicas do embrião e produzem alterações de desenvolvimento embrionário. Por exemplo, o ácido retinóico (RA) ocupada por grânulos de troca iônica é liberado ao longo de um período de 24 horas, quando implantada em um embrião de galinha e pode produzir a duplicação espelho-imagem dos dígitos 5. Heparina contas de acrílico contendo proteína FGF pode iniciar membro bud conseqüência da LPM interlimb 6. Mais recentemente rato e peixe genética tomaram o estudo da iniciação vertebrados membro em uma nova era (revisto em 7). Há boas evidências de que a AR presente em somitos antes do início do membro bud é o sinal difusível essencial pretendida pelo LPM para iniciar membro brotação. Nós quisemos explorar a acessibilidade e robustez experimental do embrião de galinha para dissecar os efeitos do implante de barreira na expressão do gene na LPM em torno do momento do início do membro bud. Uma nova adaptação do nosso método é combinar uma barreira que bloqueia os sinais provenientes de tecidos axiais com talões de lateral para a barreira a factores endógenos candidatos fornecimento exogenamente que foram bloqueados pela barreira. Os seguintes protocolos são aqueles desenvolvidos para destrinchar os mecanismos de indução botão do membro e iniciação. Estudar iniciação membro bud significa o uso de embriões em fase inicial. Muitos ovos janela pesquisadores de frango por primeiro remover alguns dos albumina através do saco de ar com uma agulha hipodérmica. O embrião, que se encontra em cima da gema, então encontram-se menor no ovo. Esta é uma vantagem para algumas técnicas, tais como electroporação, mas pode ser uma desvantagem se a manipulação cirúrgica do embrião é desejada.Encontramos tendo o embrião o mais próximo possível da abertura na ovo quanto possível, é uma vantagem. Questões permanecem sobre os sinais que controlam a indução botão do membro dos vertebrados e iniciação e os seguintes protocolos são adequados para resolvê-los. Somos o primeiro a desenvolver um protocolo para a inserção de barreiras para impedir que membros do pintainho bud crescimento numa fase mais cedo do estágio 12 8. versões modificadas destes protocolos também poderia ser usado para abordar outras questões sobre a origem eo calendário das pistas indutivos, onde um tecido indutor acessíveis, adjacente ao primórdio sendo induzido. Desde que a região do embrião é acessível na fase de desenvolvimento correspondente, em seguida, uma barreira pode ser colocado entre os dois tecidos e consequentes alterações no desenvolvimento estudados. Exemplos podem ser encontrados no desenvolvimento do cérebro, a extensão do eixo e possivelmente desenvolvimento de órgãos, tais como a indução de fígado ou rim.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&amp;nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&amp;nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>A gift from Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Remember to protect from light.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Beads for delivering protein.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Harmful, irritant, corrosive.&amp;nbsp; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Replaced by M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp;amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

O embrião de galinha fornece um modelo vertebrado excelente que pode ser usado para dissecar questões de desenvolvimento de uma forma direta. Sua acessibilidade e robustez após intervenção cirúrgica são os pontos fortes experimentais chave. Placas de mica foram as primeiras barreiras usadas para evitar membro pintainho bud iniciação 1. Protocolos que utilizam uma folha de alumínio como uma barreira impermeável à bud asa ou indução perna botão e ou iniciação são descritos. Combinamos esta técnica com laterais colocação talão para a barreira para exogenamente fatores endógenos candidatos de abastecimento que foram bloqueados pela barreira. Os resultados são analisados utilizando a hibridação in situ da expressão do gene subsequente. Nosso foco principal é sobre o papel da sinalização do ácido retinóico na indução e iniciação depois de o primeiro plano embrião de galinha e dos membros posteriores. Usamos BMS 493 (um agonista inverso de receptores do ácido retinóico (RAR)) grânulos embebidos implantados na mesoderme lateral (LPM) para imitar o efeito de uma barrarier colocado entre os sómitos (uma fonte de ácido retinóico (RA) e o LPM) a partir da qual crescem brotos dos membros. versões modificadas destes protocolos também poderia ser usado para abordar outras questões sobre a origem eo calendário das pistas indutivos. Desde que a região do embrião de galinha é acessível no estágio de desenvolvimento relevante, uma barreira pode ser colocado entre os dois tecidos e consequentes alterações no desenvolvimento estudados. Exemplos podem ser encontrados no cérebro, a extensão do eixo em desenvolvimento e no desenvolvimento de órgãos, tais como a indução de fígado ou rim.

O protocolo detalhado acima descreve os métodos utilizados nos Nishimoto et al. De 2015. O artigo estuda a indução botão do membro e iniciação, tanto na frente e dos membros posteriores do embrião de galinha. Resultados após a inserção de barreiras impermeáveis para evitar o crescimento do broto do membro anterior foram publicados anteriormente 1, 2, 9, mas houve apenas barreiras que descrevem um estudo que impedem perna bud iniciação 1. Dados de membro posterior Nishimoto et al. De 2015 são aqui apresentados como resultados representativos do estudo da expressão de mRNA após a inserção de barreira. Tbx4 ​​Expressão na LPM não é suficiente para iniciar membros posteriores Conseqüência: Figuras 2B e C (Tabela 2) mostra que a inserção de barreira na fase 15 (Figura 2A) (ver protocolo 3.2) leva a ambos FGF10e expressão Fgf8 estando ausente na região da perna broto (denotado por faixa) sobre o lado direito operado. Compare com o lado não operado esquerda. No entanto, a expressão Tbx4 é observado em ambas as fases 19 e 23 de fase no lado operado (Figura 2D e E). Concluímos que a expressão Tbx4 por si só não é suficiente para iniciar a excrescência dos membros posteriores do LPM. Outros estudos em o pintainho têm sugerido que a expressão do gene Tbx é suficiente para iniciar a formação do membro anterior botão 12, 13. Figura 2C &#39;é incluído para ilustrar como uma barreira parece embutida na região da perna do embrião de pós fixação. Na maioria dos casos as barreiras foram removidas antes da hibridação in situ (protocolo 4.3). RA dos Somitos é essencial na LPM antes FGF10 Induz Limb Bud Outgrowth: A Figura 3A é uma vista esquemática que representa a adição de um grânulo distai RA embebido com uma barreira inserido na fase 15 (protocolo 3.2.1.3). Subsequentemente a esta operação excrescência brotos de membros (indicado por um asterisco) é observado no lado direito operado e Tbx4, FGF10 e Fgf8 são expressos pela raiz como são no lado do controlo para a esquerda (Figura 3B, C e D, Tabela 2) . Assim, além de RA para o LPM supera o efeito da barreira e do membro de iniciação broto rendimentos. Conclui-se que, em RA desenvolvimento normal do somitos é essencial para o LPM antes excrescência brotos de membros pode ser iniciado. Os brotos dos membros posteriores resultantes são geralmente menores do que aqueles no lado de controlo. Isto pode ser devido à dose de RA no LPM não sendo equivalente à situação de tipo selvagem. Se a dose RA é muito alto o apical ectodérmica de Ridge (AER) pode ser encurtado e botões menores resultaria14, 15. Para confirmar que a AR (a partir de somitos) na LPM é necessário para o normal iniciação brotos de membros de um agonista inverso de RAR, BMS 493, foi usado. Grânulos são implantados no LPM região perna na fase 15 (ver protocolo 3.2.1.4) (Figura 3E). FGF10 expressão é regulada negativamente após a aplicação de BMS 493 pérolas na LPM, resultando em brotos dos membros posteriores menores em comparação com o lado de controlo (Figura 3F; Tabela 3). Grânulos de controlo de DMSO não causam esses defeitos (Figuras 3G e 3H; Tabela 3). Os defeitos observados após a aplicação BMS 493 são mais leves do que os induzidos por uma operação de barreira; ou seja, FGF10 ainda está expressa e brotos dos membros são formados. É provável que isto seja porque os efeitos de BMS 493 estão restritos localmente em torno dos grânulos e podem não ser capazes de antagonizar o RA todo produzido por axitecidos al. No início Sinais axial Especifique as células LPM que decidam expressar Tbx4: Testamos quando o LPM adquire a sua capacidade de expressar Tbx4 na região potencial de formação de perna. A etapa mais próxima em que uma barreira pode ser inserido, que em seguida bloquear perna bud conseqüência, é palco 10. Somos o primeiro a desenvolver um protocolo para inserir barreiras em estágios mais cedo do estágio 12. Barreiras inseridos entre a mesoderme paraxial ea perna presuntivo LPM na fase 10 (ver protocolo 3.4) a formação dos botões perna bloco e a expressão de Tbx4 na LPM formador de perna (Figuras 2F e 2G, Tabela 2), sugerindo que é necessário um sinal a partir de tecidos axial na etapa 10 para a expressão posterior Tbx4 na LPM hindlimb. Compare este resultado com figuras 2D e E, onde a inserção barreira mais tarde permite a expressão Tbx4para ser estabelecida. Além disso, testou-se este sinal pode ser axial RA observando se o agonista inverso de RAR reduz a expressão Tbx4. A BMS 493 talão colocado na LPM hindlimb na fase 10 (ver protocolo 3.4.1.3) regula negativamente a expressão Tbx4 (Figuras 2 horas e 2?), Enquanto esferas de controlo embebidos em DMSO não afetam expressão Tbx4 (Figuras 2J e 2K). Em conjunto, estes resultados apoiam um modelo de que um sinal de AR a partir de tecidos axiais regula indução membro regulando positivamente Tbx4 no membro posterior 7 LPM. Morte pós-operatória: As Tabelas 1, 2 e 3 dão detalhes de resultados experimentais, incluindo o número de embriões de galinha que morreu pós-operação e antes da colheita. Algumas mortes são esperadas após microcirurgia desta natureza. O números de morte pode ser mantido<html> a um mínimo, certificando-se que os instrumentos são limpos, o buraco no ovo é a de tamanho mínimo exigido, que os embriões são deixados sem a protecção da fita adesiva pegajosa durante um tempo mínimo e, em conjunto com este último ponto que a operação é levada a cabo tão rapidamente quanto possível. Nenhuma dessas operações são muito demorado, mas as operações envolvendo contas e barreiras demorar um pouco mais tempo. Apesar destas medidas, as operações realizadas nos estágios iniciais e os da região de asa são mais propensos a resultar em morte. Existem grandes vasos sanguíneos em torno das regiões de formação dos membros e ruptura acidental destes navios podem levar à morte devido à perda de sangue. Nós achamos que os ovos abriu na fase 8 ou 9, cujos embriões não foram operados, muitas vezes vai morrer no dia seguinte. Portanto, a única solução para estes problemas é o de realizar um elevado número de experiências. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. marcador Alterações Gene Expression seguintes barreira ou Bead Inserção na presuntivo Leg Nível. (A) posição de exibição esquemática de barreira (linha verde) no nível de perna presuntivo (somites 26-32) em um estágio de 15 embriões. (B - E e G) análise DESEJO em embriões operados. A região de perna é descrito (entre parênteses). (B) a expressão FGF10 está ausente na LPM operado, mas a expressão robusta é detectado pela raiz esquerda. (C) Fgf8 expressão está ausente no lado operado, o que sugere que não há AER. (C) O mesmo embrião antes da barreira foi removido. (D) Tbx4 é expresso na LPM ao mesmo nível rostro-caudal, como o botão de controlo. (E) Expressão Tbx4 é mantida na região da perna direita apesar da ausência de crescimento do membro. (F) Diagrama esquemático de uma fase<html> 10 embrião de galinha mostrando a posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo. (G) expressão Tbx4 está ausente na operado direito LPM (suporte). (H) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 10 mostrando BMS 493 posição de talão (círculo roxo) no nível de perna presuntivo. (I) a expressão Tbx4 é regulada negativamente no lado direito operado após o tratamento com BMS 493. (J) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 10 mostrando o controle de posição DMSO talão (círculo cinza). (K) Tbx4 é expressa no lado direito operado a um nível semelhante ao do controle do lado esquerdo após o tratamento com DMSO por si só. Este valor foi modificado a partir de 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Ausência Figura 3. RA salvamentos Membro da Bud Causada por Barreira de Inserção e é essencial na LPM Antes de Perna Bud Conseqüência. (A) Diagrama esquemático indicando posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo (somites 26-32) e um talão de RA-embebido (círculo vermelho). (B - D) RA resgates perna bud crescimento (indicado por um asterisco). (B) a expressão Tbx4 está presente na gema perna resgatado semelhante para o lado un-operado. (C) FGF10 é expresso na perna resgatado bud semelhante ao do lado operado-un. (D) Fgf8 se expressa na AER do broto perna direita resgatados. (E) esquemático indicando onde BMS 493 pérolas (círculos roxos) foram colocados na LPM perna presuntivo de estágio 15 embriões. (F) a expressão FGF10 é regulada negativamente no lado direito operado e o broto perna é pequeno BMS 49 seguinte3 tratamento. Os grânulos são asterisco. (L) esquemática semelhante à da (E), que indica a posição de controlo grânulos DMSO (círculos a cinzento). (H) esferas de DMSO (mostrados por asteriscos) não afetou a expressão FGF10 ou tamanho da perna bud. Este valor foi modificado a partir de 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fase barreira colocado (+ grânulo) * </td><td> número operado </td><td> Asa faltando ** </td><td> Asa presente ** </td><td> mortos número </td></tr><tr><td> Stage 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Stage 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (FGF4 grânulo) </td><td> 41 </td><td> 7 (falta talão) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (RA grânulo) </td><td> 75 </td><td> 9 (falta talão) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Stage 13 (talão de controle) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Barreiras folha de 0,7-1 mm colocados entre somites 15-20 e a mesoderme lateral. 0,35 mg / ml talão FGF4. 0,05-0,1 mg / ml do grânulo RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> esfera de controlo DMSO. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** estágios embriões de galinha fixos 21-23 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Ala Nível Barreira e Bead Experiment Outcomes. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fase barreira colocado (+ grânulo) * </td&gt; <td> número operado </td><td> Leg faltando ** </td><td> Leg presentes ** </td><td> mortos número </td></tr><tr><td> Stage 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Stage 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Stage 15 (talão FGF4) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Stage 15 (talão RA) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Barreiras folha de 0,7-1,3 mm colocados entre somites 26-32 e a mesoderme lateral. 0,35 mg / ml talão FGF4. 0,05-0,1 mg / ml do grânulo RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** estágios embriões de galinha fixos 18-24 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Perna Nível Barreira e Bead Experiment Outcomes. <table border = &quot;1&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot; fo: manter-com-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> número operado </td><td> Leg bud pequena </td><td> Leg brotar um pouco pequeno </td><td> Leg tamanho normal de bud </td><td> mortos número </td></tr><tr><td> BMS 493 esferas * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> grânulos DMSO ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 grânulos embebidos em 5 mg / ml BMS 493 colocado na direita do palco 14-15 LPM a nível perna. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 grânulos embebidos em DMSO sozinho colocado na direita do palco 15 LPM a nível perna. </td></tr><tr><td colspan="5"> embriões de galinha fixado em estágios 17-19. </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Perna Nível BMS 493 Bead Experiment Outcomes.

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K visualizações.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Vídeo: Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Otimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Biologia do Desenvolvimento

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biologia

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Neurociência

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Transfecção única célula em embriões de galinha

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Aplicação de barreiras impermeáveis combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Resumo

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Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Transfecção única célula em embriões de galinha

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

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