This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
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The authors declare they have no competing financial interests.

우리는 병아리 배아 사지 싹 형성을 방지하는 불 투과성 장벽의 사용을 설명한다. 이 기술은 중요한 단계들을 갖는다. 예비 실험에 따라, 우리는 9에 사용 된 경첩 모양의 장벽, 10 직선 장벽보다 훨씬 더 나은 배아에 그대로 남아 있음을 발견했다. 장벽의 말단 평평한면은 난황 막에 스틱과 장소 (그림 2C &#39;)의 장벽을 유지합니다. 프로토콜 단계 1.6에 기재된 바와 같이 알루미늄 박의 힌지 형 장벽 조심 준비 동작의 성공에 필수적이다. 두 번째 중요한 단계는 계란이 너무 오래 윈도우를 다음과 배아에서 작동하기 전에 준비를위한 인큐베이터에서 제외되지 않도록하는 것입니다. 우리의 경험에서, 배아는 동작이 수행되는 때까지 또는 배양 온도는 근처에있는 경우 동작 더 생존. 따라서 작업 가능한 빨리 수행되어야하고 계란 프롬프트를 재 밀봉LY 좋은 생존율을 보장합니다. 많은 연구자들은 인큐베이터에 달걀을 반환하기 전에 미세 다음 배아에 항생제의 드롭을 추가합니다. 액체의 존재는 위치에 잘 붙지 장벽을 막았다. 항생제의 추가도 배치 후 구슬을 제거 할 수 있습니다. 따라서 항생제, 빠른 작업 및 악기에 좋은 청결을 사용하지 않는 것이 감염을 방지하는 것이 좋습니다. 작업의 모든 단계 다음 70 % 에탄올로 악기를 닦기 (프로토콜 단계 3.1.2.2 참조) 장벽 또는 구슬 모두 집게에 부착시킬 수있는 난황 막과의 접촉에서 스티커가되는 계기를 방지하기 위해 필수적이다. 사용하는 구슬의 두 종류가 작업 다음과 같은 장소에서 떨어질 수 있습니다. 배리어 위치 다음날 체크되었을 때 비드이 제자리에 남아 있는지 여부를 확인하기 위해 장벽을 볼 수 없었다. 비드 밖으로 떨어진 경우에 날개 꽃 봉오리 가지가 구출되지 않았다 ( <st룽&gt; 표 1). 를 주입 할 때 비드와 액체를 전송 피하는 것은 구슬 (프로토콜 2.3.2.3 참조) LPM의 절단면에 더 쉽게 스틱 것을 의미한다. 마지막 배아 수확 좋은 후속 유전자 발현 분석에 중요 직후 고정되는 것을 보장 (프로토콜 단계 4.2 참조). 이 프로토콜은, 사지 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 장벽을 사용 이전에 발행 된 실험을 수정 장벽에 대한 특정 최적의 폭을 정의하고 유전자 발현 분석 한 다음 결합 장벽 비드 위치를 소개합니다. 우리는 저렴하고 모든 실험실에서 쉽게 사용할 기존의 알루미늄 호일을 사용하여 발견, 이전에 탄탈륨 포일을 사용하는 것과 동일한 결과를 생성합니다. 호일 계내 혼성화 (도 2C &#39;)에서 수행 할 때 배아에 남아 있지만, 하나 이상의 배아 배아 손상 포일의 날카로운 모서리를 방지하기 위해 처리되는 경우, 우리는 일반적으로 제거 될 수있다. 피ILOT 연구 레그 영역 장벽의 폭이 특히 중요하다는 것을 보여 주었다. 처음 평가판을 장벽이 너무 짧습니다되었고 다리 버드 파생물을 방지하지 않았다. 1.2-1.3 mm 완전히 다리 꽃 봉오리 가지를 차단하는 장벽에 대한 최적의 폭이다. 하나 정확하게 배치 할 수있는 좁은 날개 장벽은 꽃 봉오리 가지가 가장 생존율을 줄 방지합니다. 이것은 0.5 내지 0.7 mm만큼 좁아 질 수있다. 그러나, 조금 더 넓은 장벽 (우리는 0.7-1 mm를 사용)가 배치 약간의 부정확성을 허용하기 때문에 날개 꽃 봉오리 가지의 완전한 차단이 발생할 가능성이 더 높습니다. 혈관의 회피는 때 절개를 만드는 것은 날개 꽃 봉오리 수준의 장벽 중요합니다. 반 투과 장벽은 이전에 병아리 사지 꽃 봉오리를 양분하는 데 사용되었다. MacCabe과 파커, 1976 Summerbell 1979 년 모두 사용되는 필터는 각각 0.45 μm의 0.8 μm의 기공 크기, 16, 17. 그들은 확산 신호가 필터 및 그 구멍을 통과 할 수 있다고보고결과는 반 투과 장벽이 불 침투성 탄탈 박 장벽없이 존재하는 장벽과 하나 사지 꽃 봉오리 사이의 중간이었다 사용되었습니다. 이 프로토콜은 크기 나 확산 신호의 동적을 수정하는 기초 후보 신호를 구별하기 위해 다양한 기공 크기의 반 투과 장벽을 사용하도록 구성 될 수있다. 이 프로토콜은 주로 모델 생물 자체와 관련된 다양한 제한 사항이 있습니다. 이러한 기술은 사지 개발에 추가 질문도 척추 동물 배아의 다른 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 단은 병아리 배아 개입에 액세스 할 때 해당 기관 / 지역 개발해야한다는 것입니다. 장벽이 배치 될 필요가있는 영역의 큰 혈관의 존재는 차단 위치 이후 단계 13 또는 14보다 기술적 도전한다. 큰 혈관 장벽 배치하는 동안 절단하는 경우이 태아 사망의 원인이 될 수 있습니다. 전사가 T 요인을 때의 조사bx5 및 Tbx4가 먼저 LPM에 유도는 우리가 나중에 각각 반대 하나 날개 또는 다리 새싹을 끝낼 것 장벽을 배치 할 수있는 초기 단계에 의해 제한되었다. 낭배에 가까운 초기 단계에서 TBX 유전자 도입을 차단하는 시도를 조명 할 수있다. 초기 배리어가 추정 윙 영역에 배치 될 수 성공적 스테이지 (8)이었고, 이후의 급속한 성장은 배리어 결과를 변위 때문에 다리 영역 스테이지 (10)에서이 프로토콜은 아마도 사지 싹 단계 이후의 유전자 발현 연구에 적합하지 않다 단지 배리어의 초기 위치에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 병아리 배아의 한계를 관련하는 데, 다른 척추 동물 모델 생물을 통해 그 장점이 많다. 병아리 배아는 척추 동물 배아의 물리적 간섭이 유형의 매우 적합한 동물 모델이다. 배아 비교적 크고 throu 쉽게 접근달걀 껍질을 GH. 하나는 추가 실험을위한 배아로 돌아갈 수 있습니다 (예를 들면, 비드 (18) 또는 장벽의 제거) 또는 단순히 테이프 창을 제거하여 진행 상황을 확인. 라이브 영상 또는 시간 경과 영상을 포함 가능 범위가 있습니다. 우리는 특히 초기 단계의 배아에서 작동에 적합 닭 계란을 윈도하는 방법을 설명합니다. 사지 연구의 경우에 각 생물학적 복제 이상적인 내부 대조군으로서 작용 각 실험에 대한 반대측 제어 사지가 매우 중요하고 유용하다. 신호 분자에 침지 사지 가지 비즈 않도록 투과성 장벽을 이용하는 조합은 이전에보고되지 않았다. 이러한 개입을 다음과 mRNA 발현의 우리의 분석은 또한 소설이다. 이러한 기술은 사지 특정 전사가 Tbx5 및 Tbx4도 LPM에 유도하는 요인 때의 어려운 문제를 해부 할 수있게이상, 종래 새싹 개시 사지 것을 보여주기 위해 상기 LPM TBX 이러한 유전자의 존재 Fgf10 전사의 활성화 및 사지 싹 생장 개시 충분하지 않다. 2G, 2D 및 2E는 또한 이러한 결과를 도시한다. 그림 2G에서 스테이지 (10)에서 장벽의 삽입 다음 Tbx4 식의 부재는 Tbx4의 유도 후, 단계 15에서 장벽 삽입 다음 2D 및 2E에서 자신의 존재에 대한 대조적이다. RA 배어 구슬의 주입 장벽 삽입 및 사지 꽃 봉오리 가지 시작하기 전에 LPM에 필수 인 somites에서 RA 너무 포인트를 다음과 사지 버드 개시의 구조를 촉진. 이러한 기술은 사지 개발에 더 질문뿐만 아니라 척추 동물 배아의 다른 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌, 눈과 트렁크의 분야 적합 할 것으로 보인다.

고전 발생 학자들은 전통적으로 배아 발달을 조절하는 메커니즘을 심문하는 물리적 인 기술을 사용. 1960 년대와 1970 년대 연구자들은 배아 동안 유도 신호의 중요성을 보여주기 위해 개발 배아의 조직 사이에 삽입 불 투과성 장벽을 사용하는 기술을 개발했다. 우리의 관심은 사지 꽃 봉오리 가지를 앞에 어떤 이벤트 척추 사지 개발에 특히입니다. 예를 들어, 배리어 삽입는 반대측, 작동이되지 않는 측에서 정상적으로 진행시키면서 병아리 배아의 한쪽에 발생하는 사지 싹 생장을 방지 할 수있다. 이러한 장벽을 변화하기 위해 사용 재료; 예를 들어, 운모 판 (1) 및 탄탈륨 호일이. 이 장벽은 효과적으로 somites에서 사지 꽃 봉오리 형태, 근축 중배엽에서 형성되는 측면 판 중배엽 (LPM)를 분리합니다. 외과 이식 기술은 가까운 관계 위트를 보여사지 꽃 봉오리 개시가 LPM 3 사에서 발생하는 경우 시간이 somites이 필수적이다. 80 년대와 90 년대에 발달 생물 학자들은 발달 과정을 조절하는 필수적인 신호 분자 확산을 발견했다. 이러한 신호 전달 분자와 적신 비즈는 배아의 특정 지역에 이식 및 배아 발달에 변화를 생성 할 수 있습니다. 병아리 배아 주입 및 숫자 5의 거울상 중복을 생성 할 때, 예를 들어, 이온 교환 비드 차지하는 레티노 산 (RA)가 24 시간에 걸쳐 방출된다. FGF 단백질을 함유 헤파린 아크릴 구슬은 interlimb의 LPM 6에서 사지 꽃 봉오리 가지를 시작할 수 있습니다. 최근에 마우스와 물고기 유전학 (7 검토) 새로운 시대로 척추 사지 개시의 연구를 수행하고있다. 사지 싹 개시 전의 somites에서 RA 존재는 LP에 필요한 필수적인 확산 신호 인 것이 좋은 증거가있다M은 사지 신진를 시작합니다. 우리는 사지 꽃 봉오리 개시시 주변의 LPM에서 유전자 발현에 장벽 주입의 효과를 해부하는 병아리 배아의 접근성과 실험 견고성을 악용하고 싶었다. 우리의 방법의 새로운 적응은 장벽을 결합하는 것입니다 장벽에 의해 차단 된 외생 적 공급 후보 내생 적 요인 장벽에 비드 배치 측면과 축 조직에서 블록 신호. 다음 프로토콜은 사지 봉오리 유도 및 개시의 메커니즘을 애타게하기 위해 개발 된 것들이다. 사지 꽃 봉오리 개시를 공부하는 것은 초기 단계의 배아를 사용하는 것을 의미한다. 먼저 피하 주사 바늘로 공기 주머니를 통해 알부민의 일부를 제거하여 많은 연구자 창 닭고기 달걀. 노른자의 상단에 놓여 배아는 다음 계란에 낮은 거짓말을합니다. 이는 전기 일부 기술에 대한 장점이지만, 배아 수술 조작을 원하는 경우 단점이 될 수있다.가능이 장점으로 우리는 계란의 구멍에 가까운 배아를 갖는 찾을 수 있습니다. 질문은 척추 동물의 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 제어하는 ​​신호에 대한 남아 다음과 같은 프로토콜은이를 해결하기 적합하다. 우리는 초기 단계 (12) (8)보다 단계에서 병아리 다리 버드 파생물을 방지하기 위해 장벽의 삽입을위한 프로토콜을 개발하는 첫 번째입니다. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 primordium가 유도되는에 접근 유도부 조직이 인접한 자리하고있는 곳 기원과 유도 단서의 타이밍에 다른 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 다음 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장 유도 뇌 발달 축 확장 가능성이 장기 개발에서 발견 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&amp;nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&amp;nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>A gift from Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Remember to protect from light.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Beads for delivering protein.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Harmful, irritant, corrosive.&amp;nbsp; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Replaced by M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp;amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

병아리 배아은 직접 방식으로 개발 질문을 해부하는 데 사용할 수있는 최상의 척추 동물 모델을 제공합니다. 수술 적 치료 다음의 접근성과 안정성이 중요한 실험의 강점이다. 운모 판 병아리 사지 싹 개시 한 것을 방지하기 위해 사용되는 제 장벽이었다. 날개 꽃 봉오리 또는 다리 꽃 봉오리 유도 또는 개시에 불 투과성 장벽으로 알루미늄 호일을 사용하여 프로토콜 설명한다. 우리는 장벽에 의해 차단 된 공급 후보 내생 적 요인을 외생하는 장벽에 비드 배치 측면과이 기술을 결합합니다. 결과는 다음 유전자 발현 원위치 혼성화에 사용하여 분석된다. 우리의 주요 초점은 유도에서 레티노 산 신호와 병아리 배아 앞과 뒷다리 이후 개시의 역할이다. 우리는 BMS (493) 사용 (레티노 산 수용체의 역작용을 (RAR)) 측면 판 중배엽 (LPM) 이식 불린 비드 바의 영향을 모방rier somites (레티노 산의 소스 (RA)) 및 사지 싹이 자라는에서 LPM 사이에 위치. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 유도 큐의 기원 및 다른 시점에 질문을 해결하기 위해 사용될 수있다. 병아리 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장의 유도로, 현상 뇌 축 확장 및 개발 기관에서 발견 될 수있다.

위에서 설명한 프로토콜은 니시 모토 등의 알에 사용 된 방법을 설명합니다. 2015 년 논문은 전면과 병아리 배아의 뒷다리 모두 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 연구합니다. 앞다리 새싹의 생장을 방지하기 위해 불 침투성 장벽의 삽입 다음과 같은 결과는 이전 1, 2, 9을 발표되었지만 다리 버드 개시 1을 방지 단 하나의 연구 기술 장벽이되고있다. 니시 모토 등의 알에서 뒷다리 데이터입니다. 2015 년은 장벽 삽입 다음 mRNA 발현의 연구의 대표적인 결과로 여기에 표시됩니다. LPM에서 Tbx4 표현은 뒷다리 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 : 도 2B와 C (표 2) 단계 15 (그림 2A)에서 그 장벽 삽입을 보여 모두 Fgf10 리드 (프로토콜 3.2 참조)및 Fgf8 표현은 운영 오른쪽에 (괄호로 표시) 다리 새싹 지역의 결석. 작동이되지 않는 왼쪽 비교. 그러나 Tbx4 식은 조작 측 (도 2D 및 E)의 양 단 (19)과 스테이지 (23)에서 관찰된다. 우리는 혼자 Tbx4 표현은 LPM에서 사지 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 결론 지었다. 병아리의 다른 연구 TBX 유전자 발현은 앞다리 봉오리 형성 (12, 13)을 개시하기에 충분한 것을 제안했다. 도 2c는 &#39;장벽이 배아 포스트 고정의 다리 부분에 새겨 져 보이는 방법을 설명하기 위해 포함되어 있습니다. 경우 장벽의 대부분에서 사전 현장 하이브리드 (프로토콜 4.3)의에 제거 하였다. Somites에서 RA는 Fgf10 유도 사지 버드 O 전에 LPM 필수적이다utgrowth : 도 3A는 스테이지 (15) (프로토콜 3.2.1.3)에 삽입 배리어에 RA 침지 비드 선단부의 추가를 나타내는 개략도이다. (별표로 표시)이 작업 사지 꽃 봉오리 가지가 컨트롤 왼쪽에있는대로 봉오리로 표현되는 동작 오른쪽과 Tbx4, Fgf10 및 Fgf8에 관찰 이후 (그림 3B, C 및 D, 표 2) . 따라서, LPM에 RA를 첨가 배리어 사지 싹 개시 진행의 효과를 극복한다. 우리는 사지 꽃 봉오리 가지가 시작되기 전에 somites에서 정상적인 개발 RA의 LPM에 필수적이라고 결론 지었다. 얻어진 사지 싹은 제어 측보다 일반적으로 작다. 이 LPM은 야생형 상황에 해당하지 인에서 RA 용량 때문일 수 있습니다. 적경 용량이 너무 높으면 꼭대기 외배엽 릿지 (AER)를 짧게 할 수 있고 작은 싹 초래14, 15. LPM에서합니다 (somites에서) 그 RA를 확인하는 것은 정상적인 사지 꽃 봉오리 개시 RAR, BMS (493)의 역작용 필요, 사용되었다. 비즈 스테이지 (15)의 다리 지역 LPM에 주입된다 (그림 3E)을 (프로토콜 3.2.1.4 참조). Fgf10 식 제어 측 (표 3도 3f)에 비해 작은 사지 싹 결과 493 비즈 LPM에서 BMS의 다음 프로그램을 하향 조절한다. 제어 DMSO 비즈는 이러한 결함 (표 3도 3G 및 3H)를 발생하지 않습니다. BMS (493) 애플리케이션에 따라 관찰 된 결함은 배리어 조작에 의한 것보다 온화한; 즉,이 Fgf10 여전히 표현과 사지 싹이 형성된다. BMS 493의 효과가 구슬 주위에 로컬로 제한되며, AXI에 의해 생성 된 모든 RA를 적대시하지 못할 수 있기 때문 될 가능성이 높습니다등 조직. 조기 축 신호는 나중에 Tbx4 급행 LPM 셀을 지정합니다 : LPM은 미래의 다리 형성 영역에서 Tbx4을 표현하는 능력을 획득 할 때 우리는 시험했다. 장벽 이후 다리 버드 파생물을 차단하는 것 삽입 할 수있는 초기 단계는, 우리는 무대보다 이전 단계에서 근축 중배엽 및 추정 다리 사이에 삽입 (12) 장벽 장벽을 삽입하는 프로토콜을 개발 최초로 단계 10입니다 스테이지 (10)에 LPM은 스테이지 (10)의 축선 조직에서 신호의 이상 발현을 위해 필요하다는 것을 시사 블록 레그 봉오리 형성 레그 형성 LPM을에 Tbx4의 발현 (도 2F 및 2G, 표 2) (프로토콜 34 참조) 뒷다리 LPM에서 Tbx4. 나중에 장벽 삽입 Tbx4 식을 수도 2D 및 E와이 결과를 비교설립합니다. 또한, 우리는이 축 신호가 RAR의 역작용이 Tbx4 발현을 저하 여부를 관찰하여 RA가 될 수 있는지 여부를 테스트했다. 스테이지 (10) (프로토콜 3.4.1.3 참조)에서 뒷다리 LPM에 배치 BMS 493 비드 DMSO에 배어 제어 비즈 Tbx4 식 (도 2J 및 2K)에 영향을주지 않는 반면, Tbx4 식 (그림 하반기 및 2I)을 downregulates. 함께, 이러한 결과는 축 조직에서 RA 신호가 긍정적으로 뒷다리 LPM 7 Tbx4을 조절함으로써 사지 유도를 조절하는 모델을 지원합니다. 수술 후 죽음 : 표 1, 2 및 3에 게시 작업 수확 전에 사망 병아리 배아의 개수를 포함한 실험 결과의 세부 사항을 제공한다. 일부 사망이 자연 미세 후 예상하여야한다. 숫자의 죽음은 유지 될 수있다<html> 악기가 깨끗한 지 확인함으로써 최소로, 계란의 구멍은 배아이 마지막 지점 운영과 함께, 최소한의 시간에 대한 접착 테이프 인감의 보호없이 왼쪽되어, 최소 크기 필요하다 가능한 빨리 수행된다. 이러한 작업 중에 아주 많은 시간이 소요되지만 구슬과 장벽을 포함하는 작업이 좀 더 시간이 걸릴 수 없습니다. 이러한 조치에도 불구하고, 작업은 초기 단계에서 수행과 날개 지역의 사람들은 사망을 초래할 가능성이 더 높습니다. 죽음으로 인한 혈액 손실로 이어질 수있는 사지 형성 지역과 이들 선박의 사고 파열 주변의 큰 혈관이 있습니다. 우리는 계란 누구의 배아에 작동되지 않은, 종종 그 다음날에 의해 죽을 것이다 단계 8 또는 9에서 열 것을 찾을 수 있습니다. 따라서이 문제의 유일한 해결책은 실험의 높은 숫자를 수행하는 것입니다. D / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; 추정 다리 수준에서 배리어 또는 구슬 삽입을 다음 그림 2. 마커 유전자 발현의 변화. (A) 단계 15 배아의 추정 다리 레벨 (somites 26-32)에서 도식 보여주는 장벽 위치 (녹색 선). (B - E 및 G) 운영 배아에 위시 분석. 다리 지역 (괄호)에 설명되어있다. (B) Fgf10 식은 작동 LPM에 존재하지만 강력한 발현 왼쪽 뇌에서 검출된다. (C) Fgf8 발현은 AER이없는 암시 상기 구동 측 부재. (C &#39;) 장벽이 제거되기 전에 동일한 배아. (D)은 제어 Tbx4 새싹 같은 rostro - 꼬리 LPM 수준에서 표현된다. (E) Tbx4 발현 사지 성장의 부재에도 불구하고 오른쪽 다리 영역에 유지된다. (F) 단계의 개략도<html> 추정 적 다리 수준에서 차단 위치 (녹색 선)를 보여주는 10 병아리 배아. (G) Tbx4 표현식은 운영 오른쪽 LPM (브라켓)에 존재하지 않는다. (H)를 추정 다리 수준에서 BMS 493 비드 위치 (보라색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도. (I) Tbx4 식 BMS 493 (J) 제어 DMSO 비드 위치 (회색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도 치료 다음 운영 오른쪽에 하향 조절된다. (K) Tbx4 단독 DMSO로 처리 추종 제어 좌측과 유사한 수준에서 작동 오른쪽에 표시된다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> D / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. RA 구출 사지 버드의 부재는 배리어 삽입에 의한과 다리 버드 파생물에 앞서 LPM에서 필수입니다. (A)를 추정 다리 레벨 (somites 26-32)와 RA-적신 비드 (빨간색 원)에서 차단 위치 (녹색 선)를 나타내는 개략도. (B - D) (별표로 표시) RA 구출 다리 꽃 봉오리 가지. (B) Tbx4 발현은 수술하지 않은면에 동일한 구조의 다리 뇌에 존재한다. (C) Fgf10은 구출 다리되지 않은 운영 측면과 유사한 꽃 봉 오리 표현된다. (D) Fgf8는 구출 오른쪽 다리 버드의 AER 표현된다. BMS 493 비즈 (보라색 원)가 단계 15 배아의 추정 다리 LPM에 배치 된 위치 (E) 도식을 나타낸다. (F) Fgf10 표현은 운영 오른쪽에 하향 조절하고 다리 새싹 작은 다음과 BMS 49입니다(3) 치료. 비즈는 * 표입니다. 제어 DMSO 비드 (회색 원)의 위치를 나타내는 (E) 내지 (G) 유사 개략도. (별표로 표시) (H) DMSO 비즈 Fgf10 표현이나 다리 봉오리의 크기에 영향을 미치지 않았다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * </td><td> 수 운영 </td><td> 날개없는 ** </td><td> 윙 본 ** </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 14 </td><td> (40) </td><td> (24) </td><td> 1 </td><td> (15) </td></tr><tr><td> 단계 8/9 </td><td> (65) </td><td> (23) </td><td> 0 </td><td> (42) </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 13 (FGF4 비드) </td><td> (41) </td><td> 7 (비드 누락) </td><td> (17) </td><td> (17) </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 13 (RA 비드) </td><td> (75) </td><td> 9 (비드 누락) </td><td> (32) </td><td> (34) </td></tr><tr><td> 스테이지 (13) (제어 비드) </td><td> (5) </td><td> 삼 </td><td> 0 </td><td> 이 </td></tr><tr><td colspan="5"> * somites 15 ~ 20과 측면 판 중배엽 사이에 위치 0.7-1 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO 제어 비드. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 병아리 배아 고정 단계 21-23 </td></tr></tbody></table> 표 1. 윙 레벨 장벽과 구슬 실험 성과. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * </TD&gt; <td> 수 운영 </td><td> 다리 누락 ** </td><td> 다리 본 ** </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 15 </td><td> (43) </td><td> (39) </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 무대 10/11 </td><td> (23) </td><td> (16) </td><td> 0 </td><td> (7) </td></tr><tr><td> 스테이지 15 (FGF4 비드) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> (5) </td><td> 삼 </td></tr><tr><td> 스테이지 15 (RA 비드) </td><td> (18) </td><td> 0 </td><td> (18) </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * somites 26-32과 측면 판 중배엽 사이에 0.7-1.3 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 병아리 배아 고정 단계 18 ~ 24 </td></tr></tbody></table> 표 2. 다리 레벨 장벽과 구슬 실험 성과. <table bor데르 = &quot;1&quot;FO : 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;FO : 유지 -에 - next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 수 운영 </td><td> 다리는 작은 꽃 봉오리 </td><td> 다리가 약간 작은 꽃 봉오리 </td><td> 다리 새싹 정상 크기 </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> BMS 493 구슬 * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (15) </td><td> (12) </td><td> 삼 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO 비즈 ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (12) </td><td> 0 </td><td> 삼 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 5 밀리그램에 담가 2 ~ 3 구슬 / ㎖ BMS 493 다리의 수준에 적절한 단계 14 ~ 15 LPM에 위치. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO에 배어 ** 2-3 구슬 혼자 다리의 수준에 적절한 단계 15 LPM에 위치. </td></tr><tr><td colspan="5"> 병아리 배아 단계에서 고정 (1)7-19. </td></tr></tbody></table> 표 3. 다리 레벨 BMS 493 구슬 실험 성과.

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K 조회수.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

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Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

최적화<em&gt; 전 비켜</em&gt; 개발의 고급 단계에 병아리 배아의 배양

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

연구

발생학

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

생물학

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

장기를위한 잠수 필터 종이 샌드위치<em&gt; 예 비켜</em초기 병아리 태아의&gt; 시간 경과 영상

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

신경과학

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

칙 태아의 단일 세포 Transfection

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Soaked-Bead Assay를 사용한 닭 배아 발생 동안의 세포 분화, Morphogenesis, 및 패터닝 분석

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

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