This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.

Declaração de Ética: Todas estas experiências seguem o cuidado com os animais e as diretrizes éticas da Universidade de Nottingham. 1. Preparação de heparina Beads para enxertia <ol><li> Lave cuidadosamente contas de heparina em PBS antes da utilização. Nota: contas podem ser armazenadas a 4 ° C como uma suspensão em PBS. <ol><li> Seleccionar os grânulos para enxerto, removendo-os do estoque com uma pipeta de 20 uL a uma queda de 1 ml de PBS. Em seguida, usar uma micropipeta ajustado para 2 ul de transferência de contas em uma gota de 20 ul de PBS numa placa de petri de 3 cm. Escolha grânulos com base no tamanho e, usando um aparelho de som microscópio de dissecação, transferir grânulos selecionados com uma ponteira P2; aqueles em torno de 100 mm de diâmetro são ideais. </li></ol></li><li> Remover o PBS a partir dos grânulos. Remover a maior parte do líquido, com uma pipeta de 20 uL e o líquido residual por acção capilar com fórceps de relojoeiro finas. Nota: É importante remover tanto quanto possível de modo que o crescimento factoR não é diluído quando é adicionado aos grânulos. </li><li> Pipetar o factor de crescimento directamente sobre as esferas. Para FGF18 adicionar 0,5 mL de FGF18 recombinante reconstituído a 0,5 mg / ml em 0,1% de BSA em PBS. Coloque várias gotas de água em torno das bordas do recipiente para evitar que o líquido se evapore. </li><li> Incubar os grânulos durante 1 h à TA. Retirar as gotas de água do prato com uma pipeta Pasteur e colocar em gelo pronto para enxertia. </li><li> Se necessário (para contas transparente) a transferência de contas de 4-5 a 2% de fenol vermelho antes de enxertia para ajudar a visualizar-los. Enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião. </li></ol> 2. Preparação de grânulos AG 1-X2 para enxertia <ol><li> Antes de usar derivatizar os grânulos com 0,2 N de ácido fórmico. <ol><li> Para fazer isso uso de uma espátula para transferir esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1 mL de 0,2 N de ácido fórmico e lavar numa plataforma de agitação durante 1 h. </li><li> Em seguida, retire o ácido fórmico com uma pipeta P1000 e substituir por umml de água. Lavar durante 1 hora e repetir seis vezes para remover o restante ácido fórmico. </li><li> Remover o líquido remanescente com uma pipeta P1000 e armazenar as pérolas a 4 ° C. Nota: Não é necessária para remover a água residual todos nesta fase. </li></ol></li><li> Retirar uma pequena pastilha de grânulos de cerca de 5-10 ul de volume a partir do estoque usando uma pequena espátula numa placa de petri de 3 cm e adicionar 1 ml de DMSO (ou qualquer outro solvente, o fármaco é dissolvido em). Nota: Isso deve fornecer várias centenas de grânulos a partir da qual para selecionar aqueles do tamanho certo. </li><li> Em seguida, utilizar uma pipeta P2 definido para 2 ul para transferir os grânulos de cerca de 100 um de diâmetro para uma gota de 20 ul de solvente na outra placa de Petri de 3 cm. </li><li> Remover o solvente com uma pipeta de 20 uL e qualquer solvente residual com uma pipeta de 2 ul. Substituir com 20 ul de fármaco a ser aplicado. NOTA: Para consistência dissolver o medicamento a uma concentração de 100 uM em DMSO (ou que nunca é utilizado solvente),aliquota em 20 ul e armazenar a -80 ° C, tal como algumas pequenas moléculas inibidoras são instáveis ​​e é melhor para evitar ciclos repetidos de congelação-descongelação. Se necessário, em seguida diluir a droga para a concentração desejada antes de embeber os grânulos. As concentrações eficazes podem necessitar de ser determinada empiricamente para cada fármaco. </li><li> Incubar durante 1 h. Proteger da luz como muitas destas moléculas são sensíveis à luz. </li><li> Antes de enxerto de transferência 4-5 grânulos com uma pipeta P2 definido para 2 mL em 20 mL de 2% de fenol vermelho dissolvidos em água. Execute esta etapa utilizando um microscópio de dissecação estéreo para visualizar as esferas. Remover um único talão com relojoeiros pinça fina ou um laço de arame e enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião. Não deixe grânulos em 2% de fenol vermelho por mais de 15 min antes do uso, pois isso pode causar perda de atividade. </li></ol> 3. Preparação de tungstênio Needles <ol><li> Corte fino fio de tungstênio em 3-4 comprimentos cm. Inserir um pedaço de fio para dentro da extremidade deuma pipeta de Pasteur de vidro e derreter em um bico de Bunsen para fixar na posição. Prepare-se para 10 agulhas para garantir que não há peças de reposição se eles estiverem danificados durante a utilização. </li><li> Coloque a extremidade do fio em uma chama maçarico e mantê-lo lá até que o tungstênio brilha branco e na ponta é afiada (cerca de 2-3 min). Nota: Durante a utilização a agulha pode ser limpo e re-afiada no maçarico, conforme necessário. NOTA: Estes agulhas também pode ser usado para fazer ciclos de transferência de grânulos. Toque suavemente a agulha para o banco e que se curva para formar um laço. </li></ol> 4. Os embriões Preparando para Bead Enxertos <ol><li> Incubar os ovos com o brusco fim até que eles atinjam o estágio desejado (3-5 dias para a maioria das manipulações de bud membro). Usando uma pinça sem corte torneira no fim brusco para quebrar a casca e depois usar a pinça para remover a casca e expor o embrião. Certifique-se a membrana da casca do ovo também é removido. NOTA: 1-2 ml de PBS pode ser adicionado com uma pipeta de Pasteur para auxiliarisso se a membrana adere à gema. Pipeta suavemente o PBS sobre a superfície da gema, segure a membrana com a pinça, tomando cuidado para não danificar a gema, e puxe-o para longe do óvulo. </li><li> Remove-se a 5 ml de albumina de ovo com uma seringa de 10 ml e uma agulha 19 G. Leve somente tanto quanto necessário para assegurar o embrião não faz contato com a fita usada para selar o ovo como a remoção de volumes maiores podem reduzir as taxas de sobrevivência de embriões. </li><li> Para visualizar o embrião adicionar 5-6 gotas de tinta india artistas para 15 mL de PBS contendo 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml. Injectar 0,5-1 ml diretamente sob o embrião com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25 G. </li><li> Adicionar 2-3 ml de PBS com 1% de soro fetal de vitelo e 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml para dentro do ovo para assegurar o embrião não desidrata. Usando afiadas relojoeiros fórceps remover a membrana vitelina e abrir o amnion ao longo dos brotos de membros em desenvolvimento. Certifique-se de que o embrião não secar eSe necessário, adicione mais PBS / FCS. NOTA: Os brotos dos membros pode ser visto claramente como excrescências emparelhados sobre o flanco do embrião. Nessas etapas o embrião vai virar o lado direito é tal normalmente mais elevada. Como resultado, é normalmente mais fácil de enxertar miçangas nas extremidades direita e use os que foram deixados como controle contralateral. </li><li> Usar um fio de tungsténio afiada para fazer uma incisão no botão do membro em que o talão irá ser implantado. Evite cortar todo o caminho através do botão do membro, sempre que possível, embora em estágios mais jovens isso é difícil. NOTA: Em embriões mais velhos (HH estágio 22 e acima) é possível seleccionar regiões específicas do broto de membro para enxertia, mas em estágios mais jovens isto é mais difícil como o membro brotar em si é pequeno. É também importante recordar que o botão de membro irá crescer passado o grânulo enxertado assim, especialmente nas fases mais jovens, o rebordo irá permanecer no coto proximal. </li><li> Pegar um talão de qualquer fator de crescimento ou de drogas usando wa extra finotchmakers fórceps ou um laço feito de uma agulha de tungstênio. Se o talão foi embebido em DMSO ou vermelho de fenol, lavar em PBS antes de se aplicar ao embrião. Transferir o talão para o embrião com o ciclo de fórceps / fio. Em seguida, use o fio de tungstênio afiadas para inserir o talão na incisão. </li><li> Adicionar 1-2 ml de PBS / FCS para o ovo assegurar que o embrião é mantido hidratado mas evitar aplicar directamente sobre o próprio embrião como esta pode danificar os embriões e fazer com que o cordão de ser desalojado. Fecha-se o ovo com fita e voltar para a incubadora. </li></ol>

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S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scatter+factor/hepatocyte+growth+factor+(SF/HGF)+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo.">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li><li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension.">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li><li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity.">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li><li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes.">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li><li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos.">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li><li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals.">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).</li><li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors.">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li><li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system:+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem.">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A utilização de enxertos de talão aplicados directamente para o desenvolvimento de tecidos in ovo é uma ferramenta poderosa para dissecar o papel do crescimento factor de sinalização durante o desenvolvimento dando controlo sem paralelo através da fase de desenvolvimento em que elas são aplicados e a duração da exposição. A escolha de grânulo para cada tipo de molécula é importante. Pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como os inibidores aqui descritos e ácido retinóico, ...

Embriões de aves forneceram uma ferramenta poderosa para o estudo do desenvolvimento de muitos anos 1. Uma das suas características mais útil é que eles são relativamente fáceis de manipular. Desenvolvimento externo faz com que seja possível abrir o ovo para aceder ao embrião e executar várias micromanipulations incluindo exemplos, tais como o sistema de quimera de codorniz-do pintainho clássica para o estudo de 2,3 destino celular, a injecção de retrovirus para a sobre-expressão em tecidos específicos durante o desenvolvimento 4,5 e cultura explante para identificar fontes de sinalização de desenvolvimento 6. Mais recentemente quimeras gerado entre hosts não marcados com enxertos de uma linha de galinha transgênica expressando GFP mostrou que a combinação de enxertia clássica e modificação genética pode fornecer importantes insights sobre o desenvolvimento 7,8. A facilidade com que o embrião aviário pode ser manipulado fez-se um excelente modelo para o estudo do membrodesenvolvimento 9. Aplicação de fatores de crescimento específicos para membros em desenvolvimento in vivo tem sido fundamental na identificação de fatores que alteram membro padronização 10,11 e continua a fornecer insights sobre este processo 12. Essa abordagem também tem sido usado para estudar os fatores que regulam o desenvolvimento muscular e descobriu papéis para numerosos sinais como Wnts 13, BMPs 14 e 15 HGF. Recentemente, esta técnica tem sido utilizada para investigar os sinais que controlam a expressão do gene miogénica nos brotos dos membros e tem mostrado que as interacções entre o ácido retinóico e FGF18 pode controlar o tempo de expressão de 16 MyoD. Usando uma combinação de fatores de crescimento e moléculas pequenas que podem ser carregados em esferas e, em seguida, enxertadas diretamente em tecidos específicos em estágios de desenvolvimento definidas dá a oportunidade de intervir em quase qualquer hora e região durante o desenvolvimento. Isto tem sido utilizado para investigate muitos processos, incluindo somite padronização 17,18, especificação neural 19, migração da crista neural 20 e 21 de extensão do eixo. Descrevemos aqui um método para o enxerto grânulos embebidos em ambos os factores de crescimento no desenvolvimento de inibidores ou membros de galinha. Este foi usado para determinar os efeitos destes sinais na miogénese, analisando a expressão do gene específico do músculo com a hibridização in situ. Nós descrevemos enxertos utilizando heparina grânulos embebidos, os quais são utilizados para factores de crescimento, ou grânulos AG 1-X2 para pequenas moléculas hidrófobas tais como o ácido retinóico ou pequenas moléculas inibidoras de vias específicas de sinalização. No entanto outros grânulos também estão disponíveis, que têm sido utilizadas para entregar ambas FGF Shh 22 e 23.

<table><tbody><tr><td>Heparin acrylic beads</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,</td></tr><tr><td>AG 1-X2 beads</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel blue beads</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80&amp;deg;C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Cell Signalling</td><td>9903</td><td>Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80&amp;deg;C. Protect from light.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80&amp;deg;C. Protect from light.</td></tr><tr><td>Black Indian ink</td><td>Windsor and Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos</td></tr><tr><td>Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95%</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS</td></tr></tbody></table>

grafting of beads into developing chicken embryo limbs to identify signal transduction pathways affecting gene expression

Usando embriões de galinha, é possível testar directamente os efeitos de ambos os factores de crescimento específicos ou inibidores das vias de sinalização sobre a expressão do gene e a activação das vias de transdução de sinal. Esta técnica permite a entrega de moléculas de sinalização em estágios de desenvolvimento definidos com precisão para horários específicos. Após esta embriões podem ser colhidas e a expressão de genes examinados, por exemplo, por hibridação in situ, ou a activação de vias de transdução do sinal observado com a imunocoloração. Neste contas de heparina vídeo embebido em FGF18 ou grânulos AG 1-X2 embebidas em U0126, um inibidor MEK, são enxertados no botão do membro in ovo. Isto mostra que induz a expressão de FGF18 MyoD e fosforilação de ERK e tanto endógena e FGF18 induzida MyoD expressão é inibida por U0126. Grânulos embebidos em um antagonista do ácido retinóico pode potenciar a indução precoce MyoD por FGF18. Esta abordagem pode ser-nosed com uma vasta gama de diferentes factores de crescimento e inibidores e é facilmente adaptado a outros tecidos no embrião em desenvolvimento.

Na fase HH 21 MyoD não é expresso em mioblastos em desenvolvimento de membros embora coloração pode ser visto na miótomo dos somitos em desenvolvimento (Figura 1A). A Figura 1B mostra a hibridização in situ para MyoD 6 horas no seguimento de um enxerto FGF18 grânulo. MyoD é induzida em mioblastos perto do rebordo, enquanto não há expressão no membro contralateral. Co-enxerto de um grânulo embebido em U0126, um inibidor específico da MEK, a indução de blocos FGF1...

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Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K visualizações.  University of Nottingham. By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Vídeo: Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Otimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Biologia do Desenvolvimento

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biologia

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness following surgical intervention are key experimental strengths. Mica plates were the first barriers used to prevent chick limb bud initiation1. Protocols that use aluminum foil as an impermeable barrier to wing bud or leg bud induction and or initiation are described. We combine this technique with bead placement lateral to the barrier to exogenously supply candidate endogenous factors that have been blocked by the barrier. The results are analyzed using in situ hybridization of subsequent gene expression. Our main focus is on the role of retinoic acid signaling in the induction and later initiation of the chick embryo fore and hindlimb. We use BMS 493 (an inverse agonist of retinoic acid receptors (RAR)) soaked beads implanted in the lateral plate mesoderm (LPM) to mimic the effect of a barrier placed between the somites (a source of retinoic acid (RA)) and the LPM from which limb buds grow. Modified versions of these protocols could also be used to address other questions on the origin and timing of inductive cues. Provided the region of the chick embryo is accessible at the relevant developmental stage, a barrier could be placed between the two tissues and consequent changes in development studied. Examples may be found in the developing brain, axis extension and in organ development, such as liver or kidney induction.

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study angiogenesis but also to study tumorigenesis. After the chick chorioallantoic membrane (CAM) has developed, its blood vessel network can be easily accessed, manipulated and observed and therefore provides an optimal setting for angiogenesis assays. Since the lymphoid system is not fully developed until late stages of incubation, the chick embryo serves as a naturally immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition to nurturing developing allo- and xenografts, the CAM blood vessel network provides a uniquely supportive environment for tumor cell intravasation, dissemination, and vascular arrest and a repository where arrested cells extravasate to form micro metastatic foci.
For experimental purposes, in most of the recent studies the CAM was exposed by cutting a window through the egg shell and experiments were carried out in ovo, resulting in significant limitations in the accessibility of the CAM and possibilities for observation and photo documentation of effects. When shell-less cultures of the chick embryo were used1-4, no experimental details were provided and, if published at all, the survival rates of these cultures were low. We refined the method of ex ovo culture of chick embryos significantly by introducing a rationally controlled extrusion of the egg content. These ex ovo cultures enhance the accessibility of the CAM and chick embryo, enabling easy in vivo documentation of effects and facilitating experimental manipulation of the embryo. This allows the successful application to a large number of scientific questions: (1) As an improved angiogenesis assay5,6, (2) an experimental set up for facilitated injections in the vitreous of the chick embryo eye7-9, (3) as a test environment for dissemination and intravasation of dispersed tumor cells from established cell lines inoculated on the CAM10-12, (4) as an improved sustaining system for successful transplantation and culture of limb buds of chicken and mice13 as well as (5) for grafting, propagation, and re-grafting of solid primary tumor tissue obtained from biopsies on the surface of the CAM14.
In this video article we describe the establishment of a refined chick ex ovo culture and CAM assay with survival rates over 50%. Besides we provide a step by step demonstration of the successful application of the ex ovo culture for a large number of scientific applications. 
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, and Sebastian Gustmann contributed equally to this study.

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is a unique, naturally immunodeficient supportive culture environment to study angiogenesis and tumorigenesis. This video article demonstrates the different steps in chick ex ovo culture, application of potentially angiogenic substances and successful inoculation of tumor cells and tissues on the surface of the CAM.

Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of developing tissues and organs. This process is actively maintained in adulthood. Cell differentiation is an ongoing process during the development and homeostasis of organs. Understanding the early steps of cell differentiation is essential to know other complex processes such as morphogenesis. Thus, recombinant chicken limbs are an experimental model that allows the study of cell differentiation and pattern generation under embryonic patterning signals. This experimental model imitates an in vivo environment; it assembles reaggregated cells into an ectodermal cover obtained from an early limb bud. Later, ectoderms are transferred and implanted in a chick embryo receptor to allow its development. This assay was mainly used to evaluate mesodermal limb bud cells; however, it can be applied to other stem or progenitor cells from other organisms.

Recombinant limbs are a powerful experimental model that allows for studying the process of cell differentiation and the generation of patterns under the influence of embryonic signals. This protocol presents a detailed method for generating recombinant limbs with chicken limb-mesodermal cells, adaptable to other cell types obtained from different organisms.

Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

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Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chick^GFPe injeção de dii de corante de carbocyanina

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Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

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